王麗敏,劉詩(shī)博,郭大志,潘樹義,王振,郭博遠(yuǎn),王惠,張旭娟,趙鵬翔*,謝飛,馬雪梅

1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 北京 100124; 2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心, 北京 100048

寒冷應(yīng)激對(duì)人類，尤其是對(duì)幼兒、老年人和具有潛在疾病人群的健康危害嚴(yán)重。盡管人體可以通過(guò)自身的調(diào)節(jié)來(lái)維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)預(yù)防傷害，如通過(guò)減少熱損失和增加產(chǎn)熱機(jī)制等[1]，但長(zhǎng)時(shí)間暴露在寒冷環(huán)境下仍然會(huì)威脅人的生命安全。從生理學(xué)上講，寒冷環(huán)境的刺激會(huì)對(duì)人體多種組織器官產(chǎn)生影響，包括對(duì)呼吸系統(tǒng)[2]、血液循環(huán)系統(tǒng)[3]和心血管系統(tǒng)[4]等的影響。

傷口愈合是急性皮膚損傷后的一個(gè)重要生理過(guò)程，分為四個(gè)不同但又重疊的階段: 止血、炎癥、增生[5]、重塑[6]。和常溫條件下相比，大面積的創(chuàng)傷暴露在寒冷環(huán)境下的危險(xiǎn)性更高。已有研究表明，HBO治療可用于組織低氧癥和癌癥等疾病[7-8],也可以用于傷口的愈合[9],臨床上對(duì)急性傷口的處理中，HBO治療的氧壓力通常設(shè)置為2～2.5個(gè)絕對(duì)大氣壓(ATA)，治療時(shí)間一般為1.5～2 h[7,10]，氧氣濃度為85%～95%。一些臨床試驗(yàn)將自損傷起的一周后定義為早期干預(yù)，將自損傷起的3周后定義為晚期干預(yù)，在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)發(fā)現(xiàn)，HBO治療可以有效改善傷口部位的血流、供氧等情況[10]。而創(chuàng)后更早時(shí)間的干預(yù)可能會(huì)使活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生過(guò)多，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而在許多方面造成生理上的損害[11-12]，比如DNA突變[13]。

目前，HBO治療的機(jī)理尚未闡明，但已有研究提出了相關(guān)理論。HBO治療可能幫助恢復(fù)創(chuàng)面組織的氧水平，使得其作為電子傳遞鏈最后一步的氧促進(jìn)附近細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的生成，從而防止代謝功能障礙的細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]；HBO治療還可以增加傷口上方的含氧量[15]，隨即提高全身ROS水平使其發(fā)揮創(chuàng)傷愈合通路第二信使的功能[11]；還可通過(guò)降低腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8, IL-8)的表達(dá)來(lái)表現(xiàn)出抗炎功能[16],另外它在激活炎性小體信號(hào)功能方面也有很好的作用效果。所有這些發(fā)現(xiàn)都表明，HBO治療在一些臨床應(yīng)用方面可能是一把雙刃劍。

為了提高皮膚大面積創(chuàng)傷患者在低溫條件下的存活率，我們嘗試了不同HBO治療介入時(shí)間策略。本研究建立了c57小鼠背部皮膚全層缺損模型，提出了利用HBO治療急性創(chuàng)面的新干預(yù)策略。通過(guò)比較皮膚損傷后0、24、48 h分別介入HBO的治療效果，我們發(fā)現(xiàn)最早實(shí)行高壓氧干預(yù)治療組(0-hHBO組)的存活率更高且傷口愈合速度更快，考慮到大多數(shù)臨床試驗(yàn)均是對(duì)受傷后一周HBO治療的患者進(jìn)行的調(diào)查，本研究結(jié)果可能會(huì)帶來(lái)新的思路，即在寒冷的條件下，越早進(jìn)行HBO治療可能會(huì)給受傷患者帶來(lái)越好的預(yù)后效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所有動(dòng)物的研究都遵循中國(guó)科學(xué)院第六醫(yī)學(xué)中心生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)所認(rèn)可的章程，且實(shí)施的所有步驟程序均與中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例規(guī)定一致。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為購(gòu)自中國(guó)北京維通利華動(dòng)物科技有限公司的6周齡C57BL/6J健康小鼠，體重為20～24 g。在手術(shù)之前，小鼠需在手術(shù)室適應(yīng)環(huán)境3 d，手術(shù)室溫度為26 ℃，光照條件為12 h光照/12 h黑暗。另外，所有小鼠均可自由飲食。

抗體名稱及編號(hào)：兔抗NF-kB,編號(hào)ab16502,Abcam公司生產(chǎn)；兔抗Bcl-2 抗體,編號(hào)ab182858,Abcam公司生產(chǎn)；兔抗p-p38抗體, 編號(hào)ab4822,Abcam公司生產(chǎn)。免疫組化相關(guān)試劑購(gòu)自北京中衫金橋公司。

1.2 全層皮膚創(chuàng)傷模型

用滅菌的圓形打孔器在每只小鼠后背的皮膚上描畫1個(gè)1.2 cm直徑的圓形，然后用鑷子夾起圓形輪廓中央的部分，用剪子制造出一個(gè)不深過(guò)肌肉層的開放性傷口，然后利用尼龍線固定創(chuàng)傷上方的1.5 cm直徑的透明硅膠環(huán)，防止小鼠通過(guò)皮膚皺縮來(lái)加速傷口愈合，由此制造出一個(gè)全層皮膚缺損創(chuàng)傷模型。

1.3 利用82%濃度HBO在1.5 ATA條件下的1 h呼氧治療

給小鼠實(shí)施壓力為1.5個(gè)大氣壓，氧氣濃度為82%，穩(wěn)壓治療時(shí)間為1 h的治療方法。具體操作為：將小鼠放入HBO盒子之后，在15 min內(nèi)將壓力加至1.5個(gè)大氣壓，讓氧壓保持在該水平1 h整，之后在15 min內(nèi)降壓至最初，最后將小鼠拿出氧氣盒子。

1.4 寒冷環(huán)境條件

在自飼養(yǎng)至處死小鼠的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，溫度被嚴(yán)格控制在4～6 ℃的范圍，而且維持手術(shù)室的濕度在10%～15%的范圍內(nèi)。

1.5 免疫組化(immunochemistry, IHC)

應(yīng)用石蠟切片，片子的制作在公司完成。將切片置于70 ℃烤片機(jī)中，拷片30 min；將烤過(guò)后的切片迅速放入二甲苯中，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各放置 10 min，而后迅速放入100%、90%、80%、70% 的乙醇中各5 min，之后蒸餾水中放1 min；利用3%過(guò)氧化氫溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；組織上滴加新鮮配制的3% H2O2，室溫避光10 min，之后放入純水1 min；將切片浸入0.01 mol·L-1枸櫞酸緩沖液，微波中大火力(80%)加熱3 min，中火力(40%)加熱8 min，冷卻至室溫；使用山羊血清封閉組織，37 ℃孵育30 min；適當(dāng)稀釋抗體，4 ℃過(guò)夜孵育；利用PBS清洗一抗3次后滴加二抗，室溫條件下孵育2 h，使其充分與組織表面的抗體接觸，然后清洗；滴加1∶20稀釋的DAB工作液于組織上，顯色10 s，在顯微鏡下觀察顯色程度，蒸餾水沖洗后利用蘇木素染色3～5 min，然后用流水沖洗掉染液；1%鹽酸酒精分化1～3 s，水洗，置于自來(lái)水中浸泡返藍(lán)5～10 min；浸入80%、90%、95%和100%乙醇及兩缸二甲苯中進(jìn)行脫水、透明,滴加1滴中性樹膠于組織上，蓋玻片封片。24 h后置于顯微鏡下觀察拍照。

1.6 測(cè)量創(chuàng)傷面積

在完成動(dòng)物模型之后立即拍攝第1組圖片，之后每天在同一時(shí)間以相同的焦距拍攝小鼠的皮膚創(chuàng)傷。拍照之后利用軟件Image J來(lái)自動(dòng)計(jì)算創(chuàng)傷面積，該軟件以每張圖片中的紙質(zhì)標(biāo)尺為參照，并估算出每張圖片中創(chuàng)傷的面積。

1.7 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)資料均采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 8版本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在符合正態(tài)性和方差齊性的前提下，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±S)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述；統(tǒng)計(jì)推斷則采用t檢驗(yàn)(t-test)。所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓氧的早期干預(yù)對(duì)寒冷條件下皮膚創(chuàng)傷小鼠生存率的影響

不同的HBO干預(yù)策略對(duì)小鼠存活率影響較大。HBO組與Control組的比較表明，前者提高了創(chuàng)傷小鼠的生存機(jī)會(huì)。HBO各組之間的比較顯示，越早進(jìn)行HBO干預(yù)，存活率越高(表1)。第3天時(shí)0-hHBO組都存活,24-hHBO、48-hHBO組小鼠各自出現(xiàn)了38%、22%的死亡，而對(duì)照組(表1)小鼠出現(xiàn)高達(dá)63%的死亡。此外,在第4天,對(duì)照組中所有的小鼠全部死亡，而HBO組的小鼠44%～67%仍然存活(表1)。5 d后, HBO組沒有進(jìn)一步出現(xiàn)死鼠,第11天計(jì)算的最終死亡率中，0-hHBO是33%，24-hHBO 是50%，48-hHBO 是67%，對(duì)照組是100%。以上這些結(jié)果表明，HBO治療的早期干預(yù)，特別是在受傷后立即介入治療的策略，可以有效地減少受傷和寒冷環(huán)境所引發(fā)的死亡。

表1 小鼠在創(chuàng)傷后的不同時(shí)間介入HBO治療的死亡率Table 1 Mortality of mice by intervening HBO at different points post wounding

2.2 HBO治療及介入時(shí)間與創(chuàng)面愈合效果的關(guān)系

在傷口愈合過(guò)程中，從第一天開始，每?jī)商炫恼找淮尾z查傷口愈合情況。由于對(duì)照組小鼠第4天時(shí)死亡率達(dá)到100%(圖1A)，因此該組在第5天及之后無(wú)法收集到任何數(shù)據(jù)。如圖可以看出0-hHBO組傷口愈合速度始終是所有組中最快的，其他兩組的愈合率稍落后。從第5天開始，HBO治療組差異開始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)，揭示了依賴于介入時(shí)間的HBO治療新方法，即0-hHBO 和24-hHBO治療創(chuàng)面的愈合速率均優(yōu)于48-hHBO。因此，本研究認(rèn)為在受傷后立即進(jìn)行HBO干預(yù)是促進(jìn)傷口愈合的最佳策略。

2.3 寒冷條件下0-hHBO治療對(duì)愈合相關(guān)血液指標(biāo)的影響

上述研究已發(fā)現(xiàn)0-h HBO組在寒冷條件下的生存和傷口愈合效果最好，因此進(jìn)行了更深一步的驗(yàn)證，我們觀察了造模后第24 h時(shí)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血液的相關(guān)指標(biāo)，以確定0-hHBO治療后全身的變化。

白細(xì)胞 (WBC)數(shù)目的降低通常是低度炎癥或病毒、細(xì)菌感染的標(biāo)志[17]。本研究中，0-h HBO組和對(duì)照組的WBC計(jì)數(shù)均低于正常值，說(shuō)明免疫功能不佳(圖2A)，但前者的WBC計(jì)數(shù)明顯高于后者(圖2A)，提示HBO治療早期干預(yù)可能會(huì)幫助恢復(fù)免疫應(yīng)答；如圖2B所示，0-hHBO組的紅細(xì)胞密度大于對(duì)照組(P=0.022)，且兩組的數(shù)值均在參考范圍內(nèi)(7.5～12.5)，說(shuō)明0-hHBO治療的小鼠發(fā)生貧血的可能性較??；0-hHBO組和對(duì)照組的血小板壓積出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.009)，但兩組均在參考范圍內(nèi)(0.1～0.3)(圖2C)，這與平均血小板體積(mean platelet volume, MPV)的檢驗(yàn)一致(圖2F)，這可能與血小板在止血階段的消耗有關(guān)；兩組間的粒細(xì)胞(granulocyte, GR)和淋巴細(xì)胞(lymphocyte, LY)百分比接近，但0-hHBO組單核細(xì)胞(monocyte, MO)較少，這可能是由于在傷口部位的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變成了巨噬細(xì)胞所致，此外，兩組之間的紅細(xì)胞分布寬度(red blood cell distribution width, RDW)和紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)存在明顯差異。以上數(shù)據(jù)分析表明，0-hHBO治療效果要優(yōu)于前24 h完全不進(jìn)行HBO干預(yù)的治療方案。

A：各組小鼠在第0～11天的創(chuàng)傷拍攝圖；B：利用Image J軟件計(jì)算的創(chuàng)傷愈合率，愈合率=(第0天的面積-第n天的面積)/第0天的面積×100%。*，**，***，****分別表示同一時(shí)間不同處理間數(shù)據(jù)在P<0.05、P<0.01、P<0.001和P<0.000 1水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1 不同時(shí)間點(diǎn)介入高壓氧對(duì)創(chuàng)面愈合速率的影響Fig.1 The effect of healing rate by intervening HBO at different points post wounding

A～D：分別表示白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、表示紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、表示血小板壓積(PCT)、表示不同種類白細(xì)胞(包括粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)的比例；E：表示血細(xì)胞比容(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)和紅細(xì)胞分布寬度(RDW)；F：表示血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血小板分布寬度(PDW)和平均血小板體積(MPV)；G：表示血紅蛋白(HGB)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白數(shù)(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)。* —P<0.05, ** —P<0.01, *** —P<0.001, **** —P<0.000 1。圖2 不同時(shí)間點(diǎn)介入高壓氧對(duì)血細(xì)胞的影響Fig.2 The effect of blood cells by intervening HBO at different points post wounding

2.4 0-hHBO 與p38→NF-κB→Bcl-2分子路線的調(diào)控及對(duì)表皮干細(xì)胞等細(xì)胞中抗凋亡作用的激活

基于以上研究結(jié)果,存活率和傷口愈合速度都具有HBO 介入時(shí)間的依賴性,且創(chuàng)后立即早期干預(yù)具有最好的療效，因此猜想可能在前24 h內(nèi)小鼠的生理上發(fā)生了一些重要的變化,該時(shí)間段包括愈合過(guò)程中的炎癥階段。表皮細(xì)胞和毛囊細(xì)胞是表皮干細(xì)胞最豐富的兩個(gè)部位，它可以加速愈合速度和組織修復(fù)，因此在傷口邊緣的表皮和毛囊處進(jìn)行了免疫組織化學(xué)(IHC)試驗(yàn)以檢測(cè)炎癥和凋亡情況。

如圖3A和C所示, 0-hHBO治療24 h后,NF-κB和bcl-2在傷口處的表達(dá)升高,且強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞主要位于表皮(黑色箭頭)和毛囊(紅色箭頭)，細(xì)胞核也可見一些較深的染色;NF-κB上游信號(hào)因子之一的p-p38[18-19]。雖然在兩個(gè)組的表達(dá)都不高,但0-hHBO組在表皮和毛囊處都顯示出了弱陽(yáng)性。因此, p38→NF-κB→Bcl-2信號(hào)通路應(yīng)該是在HBO干預(yù)后被激活,并可能由此減少了表皮干細(xì)胞的凋亡率。

A～C：從左至右分別是物鏡10倍和20倍放大，黑色箭頭代表上皮區(qū)域，紅色箭頭代表毛囊;D：3個(gè)檢驗(yàn)指標(biāo)的圖解通路，其中實(shí)線表示本研究已驗(yàn)證的生物學(xué)過(guò)程，虛線表示待證實(shí)過(guò)程。圖3 IHC檢測(cè)對(duì)照組和0-hHBO的NF-kb、p-p38和Bcl-2的表達(dá)Fig.3 HE staining of two groups (0-hHBO and control) about the expressing of NF-kb,p-p38 and Bcl-2

3 討論

HBO干預(yù)是臨床和實(shí)驗(yàn)研究中最重要的課題之一[20-21]。以往的大多數(shù)HBO的研究都集中在創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injuries, TBIs)，以HBO不同的介入時(shí)間為區(qū)別的治療策略在治療急性和慢性創(chuàng)傷性腦損傷時(shí)的療效是不同的，Yang等[20]在3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)(早期、延遲、早期聯(lián)合延遲治療)的治療中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療效果最好，而較大面積的傷口，尤其是處在寒冷的環(huán)境中，對(duì)人類構(gòu)成了很大的威脅。本研究中，通過(guò)比較受傷后0、24和48 h介入HBO，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)后立即進(jìn)行HBO治療，然后每天繼續(xù)治療，直到愈合周期結(jié)束，能夠顯著提高小鼠的生存率和愈合速度。因此，針對(duì)寒冷條件下嚴(yán)重開放性傷口的治療，我們提出了一種新的策略，即無(wú)論是急性期還是恢復(fù)期，高壓氧的早期介入治療都是最佳選擇。

在寒冷環(huán)境中，影響受傷人員存活率的因素很多，如感染、循環(huán)系統(tǒng)疾病、體溫、血氧濃度、營(yíng)養(yǎng)等。本研究中，在11 d內(nèi)沒有觀察到感染，存活率的提高可能與HBO治療有關(guān)。全身血常規(guī)檢測(cè)反映了創(chuàng)后立即進(jìn)行HBO干預(yù)的24 h后，各組小鼠的整體情況均有改善,此外表皮干細(xì)胞(ESCs)被激活并從不同的皮膚區(qū)域募集至傷口處[22]，來(lái)幫助組織修復(fù)和傷口愈合，這也可能是提高存活率的一個(gè)關(guān)鍵因素。

冷應(yīng)激(5℃左右)通常會(huì)引起細(xì)胞凋亡[23-25]，而對(duì)愈合過(guò)程至關(guān)重要的ESCs也可能遭受這種情況。通過(guò)IHC檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)0-hHBO治療使得p38→NF-κB→Bcl-2通路被激活且顯示出了抗凋亡作用，特別是在ESCs豐富的地方(表皮和毛囊)，我們初步推斷HBO治療可能保留了ESCs的活性。

NF-κB的激活也可能引起下游炎癥信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),并延遲傷口的愈合，本研究中，我們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用的HBO劑量并沒有引發(fā)明顯的炎癥。我們推斷，HBO治療可能是一把雙刃劍，需要更精準(zhǔn)的生物學(xué)研究來(lái)確定冷應(yīng)激下受傷患者的干預(yù)時(shí)間和劑量，提出更佳的治療策略。

綜上所述，本研究提出了HBO干預(yù)時(shí)機(jī)的新策略，即創(chuàng)傷后立即HBO治療可以最大限度地提高冷應(yīng)激損傷小鼠的存活率和愈合速率，對(duì)處在寒冷環(huán)境下創(chuàng)傷病人的治療提供了重要的啟示。