朱瑤瑤,張朔,王征宇

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所), 實驗血液學(xué)國家重點實驗室, 國家血液病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 天津 300020

人多能干細胞(human pluripotent stem cell，hPSC)主要包括人胚胎干細胞(human embryonic stem cell，hESC)和人誘導(dǎo)多能干細胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)，其特征包括自我更新能力和多向分化潛能，是目前科學(xué)研究中常用的工具細胞系。hPSC體外造血分化為研究人體造血發(fā)育提供了一種簡便的途徑，也為探索造血發(fā)育過程中的分子動力學(xué)機制提供了新策略[1]。前期研究表明，在胚胎造血發(fā)育中主要經(jīng)歷原始造血和成年造血過程[2-3]，其中成年造血對造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)的產(chǎn)生必不可少[4-5]，因此區(qū)分原始造血和成年造血過程有利于體外產(chǎn)生功能性血細胞，也是近年來國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。

Runx1是造血發(fā)育中重要的轉(zhuǎn)錄因子，包括a、b、c 3種亞型，其中Runx1c是生血內(nèi)皮(hemogenic endothelium，HE)中唯一的亞型，也是成年HSC唯一表達的亞型[6]。前期研究表明，hESC中Runx1c的表達可以促進HE產(chǎn)生造血祖細胞(hematopoietic progenitor cell，HPC)[6]。同時，Runx1c主要表達在E10.5～E11.5的小鼠胚胎主動脈-性腺-中腎(aorta-gonado-mesonephros，AGM)區(qū)，該區(qū)域為體內(nèi)HSC產(chǎn)生的部位[7]，因此，Runx1c在HSC的產(chǎn)生過程中具有非常重要的作用。當(dāng)前，關(guān)于Runx1c和造血相關(guān)性的研究已有報道，但Runx1c在造血發(fā)育中的動態(tài)表達尚未被研究過。

近年來，CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展，已然成為基因編輯的有力手段[8]，極大地方便了科學(xué)研究的進行。因此，本研究利用該技術(shù)構(gòu)建hESC來源的Runx1c- mNeonGreen報告細胞系，并結(jié)合本實驗室前期建立的hPSC體外單層造血分化體系[9]，動態(tài)追蹤人早期造血發(fā)育中Runx1c的表達情況，以期為解析成年造血過程提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

H1-hESC細胞系購于美國Wicell干細胞庫；本研究所用質(zhì)粒均由張孝兵教授實驗室(美國羅馬琳達大學(xué)醫(yī)學(xué)院)構(gòu)建并惠贈。

Essential 8TMMedium和TrypLETMSelect (1×)購于美國Gibco公司；Corning?Matrigel?hESC-Qualified Matrix購于美國Corning公司；STEMdiffTMAPELTM1 Medium購于美國STEMCELL公司；ROCK激酶抑制劑Y27632購于美國PEPROCELL公司；骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP4)、激活素A(Activin Beta-A chain，ActivinA)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購于美國Peprotech公司；CHIR99021糖原合酶激酶3β(glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β)抑制劑購于美國ABM公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) 購于美國Roche公司；RNeasy Mini Kit(50) 購于德國QIAGEN公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304) 購于天根生化科技(北京)有限公司。

免疫熒光抗體：Oct-3/4 mouse IgG購于美國Santa Crua公司；Nanog mouse IgG購于美國BD Biosciences公司；Tra1-60 mouse IgM購于美國Millpore公司；二抗Goat anti mouse IgM Alexa Fluor 555和Goat anti mouse IgG Alexa Fluor 647購于美國Invitrogen公司。流式抗體：anti-SSEA4 Alexa Fluor 555購于美國BD Biosciences公司；anti-human Oct3/4 PE和anti-human CD34 APC購于美國eBiosciences公司；KAPA HiFi HotStart ReadyMix購于美國KAPA Biosystems公司。

1.2 hESC的培養(yǎng)和傳代

為了構(gòu)建hESC來源的報告細胞系，首先進行hESC的培養(yǎng)和傳代。H1-hESC細胞在包被有Matrigel基質(zhì)的培養(yǎng)板中懸于E8培養(yǎng)液培養(yǎng)，每日更換培養(yǎng)液，當(dāng)細胞密度達到70%～80%時，使用0.5 mmol·L-1EDTA進行傳代。首先棄掉E8培養(yǎng)液，加入EDTA消化液，使其覆蓋板底。待顯微鏡下觀察到細胞回縮變亮、克隆由致密變疏松、細胞間孔隙增大時，輕輕吸出消化液。加入E8培養(yǎng)液吹下細胞，將細胞懸液混勻后，種相應(yīng)細胞數(shù)到Matrigel基質(zhì)包被的培養(yǎng)板上。在培養(yǎng)液中加入10 μmol·L-1ROCK激酶抑制劑Y-27632，并于24 h后撤掉?？寺〖s3～4 d長好，可進行后續(xù)實驗或者繼續(xù)傳代。

1.3 利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建細胞系

為了在hESC的Runx1c位點準確插入mNeonGreen報告基因片段，利用CRISPR-Cas9技術(shù)通過核轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方式對H1-hESC進行基因組的重編輯。采用雙切質(zhì)粒載體代替?zhèn)鹘y(tǒng)載體[8]，即在同源重組(homology-directed repair, HDR)模板兩側(cè)各加入一段單向?qū)NA(single guide RNA, sgRNA)識別序列，使CRISPR相關(guān)蛋白核酸酶-9(CRISPR-associated protein-9 nuclease，Cas9)對基因組進行切割的同時也使質(zhì)粒線性化，并聯(lián)合B細胞淋巴瘤-特大(B-cell lymphoma-extra large,BCL-XL)基因瞬時過表達的方法將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進入H1-hESC(圖1)。

首先，在70 μL的核電轉(zhuǎn)溶液(lonza)中加入1 μg Cas9質(zhì)粒、0.5 μg的sgRNA質(zhì)粒、0.5 μg的sgDocut質(zhì)粒(用于切割pDonor)、1 μg pDonor質(zhì)粒和0.5 μg BCL-XL質(zhì)粒。待H1-hESC長到密度為70%左右，用TrepleE消化至單細胞，計數(shù)后取1×106個細胞，1 000 r·min-1離心5 min后棄掉上清液。用核電轉(zhuǎn)溶液重懸后，將細胞轉(zhuǎn)移至比色皿中并放入Amaxa Human Stem Cell Nucleofector?Kit 2 (lonza)電轉(zhuǎn)儀上執(zhí)行B-016程序，于37 ℃靜置5 min。將細胞接種到Matrigel包被的六孔板中，培養(yǎng)液換成E8，加入10 μmol·L-1ROCK激酶抑制劑Y-27632，放入孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)和傳代方法同1.2，并置于顯微鏡下觀察構(gòu)建后的細胞形態(tài)。

A：在Runx1c基因片段的1號外顯子(exon1)終止密碼子附近進行基因編輯；B：質(zhì)粒載體以及聯(lián)合瞬時過表達BCL-XL的基因編輯方法。LHA—左端同源臂(left homologous arm)；RHA—右端同源臂(right homologous arm)。圖1 利用CRISPR-Cas9在Runx1c位點進行基因編輯的原理圖Fig.1 Schematic diagram of genome editing at the Runx1c locus using CRISPR-Cas9

1.4 PCR鑒定基因重組類型

為了檢測基因重組的類型，在顯微鏡下挑選1.3中電轉(zhuǎn)后接種的單細胞克隆，轉(zhuǎn)移至Matrigel包被的十二孔板中培養(yǎng)。然后待細胞密度達到70%時，利用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取培養(yǎng)細胞的基因組DNA，并擴增Runx1c 1號外顯子終止密碼子附近500 bp左右的基因，檢測是否插入mNeonGreen報告基因片段，同時以野生型H1-hESC為陰性對照、質(zhì)粒pU6-sgRunx1c為陽性對照。PCR反應(yīng)體系(10 μL)為：DNA 0.5 μL，KAPA HiFi DNA polymerase 5 μL，上游引物(5′-CCAGAGGTATCCAGCAGA-3′)0.25 μL，下游引物(5′-GCACAACTTACTCGCACT-3′)0.25 μL，無核酸酶水4 μL。反應(yīng)程序為：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，68 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物大小和目的基因插入類型。

1.5 Sanger測序檢測同源重組/非同源末端結(jié)合

為了進一步檢測1.4中經(jīng)PCR鑒定為純合克隆的基因組序列是否正確，利用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取野生型H1-hESC和H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的基因組DNA。利用PCR擴增Runx1c 1號外顯子終止密碼子附近500 bp左右的基因，檢測是否插入mNeonGreen報告基因片段以及對基因序列進行二代測序。PCR所用引物、反應(yīng)體系與反應(yīng)程序均與1.4相同。將PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行Sanger測序。將測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)、Galaxy(https://usegalaxy.org/)和Cas-analyzer(http://www.rgenome.net/cas-analyzer/#!)在線分析平臺進行分析，利用Synthego(https://ice.synthego.com/)網(wǎng)站進行ICE分析。

1.6 hESC來源的mNeonGreen報告細胞系的多能性鑒定

1.6.1多能性蛋白的免疫熒光染色 為了檢測多能性蛋白的表達，在培養(yǎng)板中放入細胞爬片再包被Matrigel基質(zhì)，將細胞培養(yǎng)至密度為50%～60%，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液。隨后用PBS洗1次，用4% PFA固定30 min，再用PBST洗2次(每次15 min)。于Blocking buffer中室溫孵育1 h，加入一抗，4 ℃過夜。隨后用PBS洗2次(每次15 min)，加入二抗，37 ℃孵育1 h，再用PBS洗2次(每次15 min)。加入DAPI進行細胞核染色，5 min后用PBS洗2次。最后，取出爬片，利用雙轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.6.2實時熒光定量PCR檢測多能性基因表達

為了檢測基因OCT4、SOX2、NANOG的表達水平，利用QIAGEN RNeasy Mini Kit提取野生型H1-hESC和H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的RNA，使用NanoDrop 1000 Spectrophotometer檢測RNA濃度。隨后，利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。最后，以GAPDH作為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)。RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL)為：cDNA 1 μL，F(xiàn)aststart Universal SYBR Green Master 10 μL，上、下游引物各1 μL，無核酸酶水 7 μL。96孔PCR反應(yīng)板內(nèi)每個孔為1個反應(yīng)，按體積由大到小依次加入不同組分。封上PCR封口膜，瞬時離心混勻后放入實時定量PCR儀/Q3(Applied Biosystems)中。RT-qPCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40～45個循環(huán)。每個反應(yīng)設(shè)3個重復(fù)孔，最后結(jié)果取平均值后采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)處理。引物均由美國Invitrogen公司合成，引物序列見表1。

1.6.3數(shù)字核型 為了檢測電轉(zhuǎn)后細胞染色體核型是否發(fā)生變化，利用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的基因組DNA，進行Illumina Asian Screening Array檢測和數(shù)據(jù)分析。并利用Log R比和B等位基因頻率等算法檢測細胞的拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.6.4畸胎瘤形成實驗 為了檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞是否具有多能性，將3×106個細胞注射到NOD/SCID小鼠腹股溝皮下。注射8～12周后，小鼠有皮下腫瘤形成，完整剝離腫瘤進行組織病理切片和HE染色，在顯微鏡下觀察HE染色后的組織切片。

1.7 H1-hESC來源的mNeonGreen報告細胞系體外單層造血分化

利用本實驗室已經(jīng)建立的hPSC體外單層造血分化體系[9]進行實驗。H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞的密度達到70%～80%時，用TrypleE消化成單細胞懸液，以6×103個·孔-1接種于玻連蛋白包被的12孔板內(nèi)。更換造血誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液STEMdiff APEL，并向其中添加3 μmol·L-1GSK-3β抑制劑CHIR99021、2 ng·mL-1Activin A、10 ng·mL-1BMP4和10 μmol·L-1ROCK激酶抑制劑Y-27632，此時記為造血分化第0天(Day 0)。48 h之后(Day 2)換液，并加入10 ng·mL-1VEGF。造血分化第3天(Day 3)，直接加入10 ng·mL-1bFGF。造血分化第4天(Day 4)，換液并加入10 ng·mL-1VEGF和10 ng·mL-1bFGF的培養(yǎng)基至造血分化第6天(Day 6)。

1.8 流式細胞術(shù)檢測Runx1c的表達

為了追蹤H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系在造血分化的不同階段Runx1c的表達情況，參照1.7中的H1-hESC來源的mNeonGreen報告細胞系體外單層造血分化方法，將造血分化第2天、第4天和第6天的細胞棄掉上清液，加入TrypleE解離成單細胞懸液，1 200 r·min-1離心5 min，將細胞重懸于300 mL PBE(含2% FBS和0.5 mmol·L-1EDTA)，利用BD CantoⅡ流式分析儀檢測Runx1c-mNeonGreen的比例，并用Flowjo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

然后，從1.4中經(jīng)PCR鑒定的雜合克隆中隨機選取了28個單細胞來源的細胞系，誘導(dǎo)造血分化至第4天(方法參照1.7)，利用流式細胞術(shù)檢測不同單細胞來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的分化效率，利用BD CantoⅡ流式分析儀檢測Runx1c-mNeonGreen的比例，并用Flowjo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5軟件分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準誤(Means±SEM)表示。實驗重復(fù)3次，使用Student Test檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用CRISPR-Cas9技術(shù)高效構(gòu)建H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系

本研究采用雙切質(zhì)粒載體聯(lián)合BCL-XL瞬時過表達的方法，將pEF1-BCL-XL、pEF1-Cas9、pU6-sgRunx1c-mNeonGreen、pDonor-sg和pU6-sgDocut 5種質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進入H1-hESC(圖1)。隨后，對單細胞形成的共22個克隆分別傳代(10代以上)擴增，取其基因組DNA與野生型H1-hESC(陰性對照)和質(zhì)粒pU6-sgRunx1c(陽性對照)同時進行PCR，擴增Runx1c 1號外顯子終止密碼子附近500 bp左右的基因。若以HDR形式進行基因編輯的純合細胞克隆，PCR產(chǎn)物位置與質(zhì)粒pU6-sgRunx1c-mNeonGreen相同(1.2 kb附近)，而未進行基因編輯的細胞克隆PCR產(chǎn)物位置與野生型H1-hESC相同(500 bp附近)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在挑選的22個克隆中有3個雜合克隆、18個未編輯的克隆和1個純合克隆，基因編輯效率為18.2%(圖2A和表2)。進一步對純合克隆的PCR產(chǎn)物進行Sanger法測序，通過NCBI、Galaxy和Cas-analyzer在線分析平臺分析測序數(shù)據(jù)，并利用Synthego網(wǎng)站進行ICE分析，結(jié)果也證實目的基因片段Runx1c-mNeonGreen以HDR形式插入基因組(圖2B)。上述結(jié)果表明，成功建立了H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系。

2.2 H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系多能性鑒定

2.2.1細胞表達多能性基因和蛋白 由2.1可知，通過CRISPR-Cas9方法成功獲得了H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系，并且，其可在Matrigel包被的E8培養(yǎng)基中無限傳代。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞仍然具有正常H1-hESC樣的形態(tài)特征(圖3A)。而實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系表達多能性基因OCT4、SOX2和NANOG的水平與野生型H1-hESC沒有顯著性差異(圖3B)。同時，流式細胞分析術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)多能性蛋白Tra1-60、NANOG、OCT4的表達率均在90%以上(圖4A)。免疫熒光染色檢測胞內(nèi)蛋白和表面蛋白也證實細胞可表達多能性蛋白NANOG、OCT4和SSEA4(圖4B)。上述結(jié)果表明，已建立的H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系仍然具有多能性。

A：電轉(zhuǎn)細胞的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，E1—純合突變，E2、E3、E4—雜合突變，H1—野生基因型H1-hESC(陰性對照)，質(zhì)粒—pU6-sgRunx1c-mNeonGreen(陽性對照)；B：Sanger測序數(shù)據(jù)顯示在Runx1c 1號外顯子位點精確插入mNeonGreen序列。圖2 電轉(zhuǎn)后的PCR分析和Sanger測序情況Fig.2 PCR analysis and Sanger sequencing after electroporation

表2 不同類型的基因編輯效率Table 2 Different types of gene editing efficiency

A：H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的顯微鏡下形態(tài)；B：實時熒光定量PCR技術(shù)檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的多能性基因NANOG、OCT4、SOX2的相對表達量圖3 H1-hESC來源的Runx1c-mNeoGreen報告細胞形態(tài)及多能性基因表達Fig.3 The morphology and pluripotency gene expression of H1-hESC-derived Runx1c-mNeoGreen reporter cell line

A：細胞免疫熒光染色檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的多能性蛋白TRA1-60、NANOG和OCT4表達情況；B：流式細胞分析術(shù)檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的多能性蛋白NANOG、OCT4和SSEA4表達情況圖4 多能性蛋白檢測Fig.4 The detection of pluripotency protein

2.2.2細胞染色體核型正常 為了檢測基因編輯后是否影響基因組的穩(wěn)定性，通過Illumina Asian Screening Array進行數(shù)字化核型檢測，這種方法比常規(guī)的G-顯帶核型分析更容易識別小片段的DNA缺失或重復(fù)。分析結(jié)果表明未檢測到拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)和單核苷酸突變(single nucleotide polymorphism，SNP)。結(jié)果表明，H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的染色體核型正常(圖5)。

圖5 數(shù)字化核型檢測Fig.5 The detection of digital karyotype

2.2.3細胞具有多向分化潛能 為了檢測H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系是否具有多向分化潛能，進行了畸胎瘤形成實驗，若有內(nèi)、中、外3個胚層的組織形成，證明該細胞具有多向分化潛能。注射細胞8周后，在NOD/SCID免疫缺陷小鼠腹股溝皮下可見腫瘤形成。完整剝離腫瘤組織進行病理組織切片及H&E染色發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織具有三胚層結(jié)構(gòu)(圖6)。以上結(jié)果表明，H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系仍然具有多向分化潛能。

注：箭頭所指組織分別為氣管(外胚層)、肌肉(中胚層)、和腺體(內(nèi)胚層)。 圖6 三胚層特征Fig.6 Characterization of three germ layers

2.3 利用H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系追蹤成年造血過程

與體內(nèi)胚胎造血發(fā)育相似，hPSC體外造血分化一般可分為以下步驟：Brachyury(T)+中胚層誘導(dǎo)，CD34+CD144+HE特化，最后經(jīng)過內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)變(endothelial-to-hematopoietic transition，EHT)產(chǎn)生CD43+HPC[10-12]。為了探究H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系在造血分化中的示蹤作用，利用之前建立的逐級造血分化體系[9]，檢測早期造血發(fā)育不同階段Runx1c的表達。如圖7A所示，造血分化第0天到第2天(Day 0—Day 2)是中胚層形成階段，Activin A、BMP4和Wnt信號通路激活劑(CHIR99021)可以加速Brachyury+中胚層祖細胞(mesodermal progenitor，MP)的產(chǎn)生；第2天到第4天(Day 2—Day 4)是HE特化階段，在VEGF和基礎(chǔ)成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的誘導(dǎo)下產(chǎn)生CD34+CD144+HE；第4天到第6天(Day 4—Day 6)是EHT階段，在VEGF和bFGF的持續(xù)誘導(dǎo)下，在第6天可以產(chǎn)生CD43+HPC。隨后，在造血分化第0天將純合H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系和H1同時進行造血分化誘導(dǎo)，利用流式細胞術(shù)在分化的不同階段檢測Runx1c的表達(圖7B)。

進一步隨機選取了雜合的其他28個單細胞來源的細胞系，誘導(dǎo)造血分化至第4天，利用流式細胞術(shù)檢測不同單細胞來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的分化效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Runx1c在造血分化第2天就已表達，在接下來的HE特化階段和EHT階段持續(xù)表達，但是表達水平逐漸下降(表3)。上述結(jié)果表明，成功構(gòu)建了H1-hESC來源的純合和雜合Runx1c-mNeonGreen報告細胞系，在本實驗室的單層造血分化體系中，有誘導(dǎo)分化第2天時，主要由中胚層構(gòu)成[9]，而造血系統(tǒng)來源于中胚層，因此，提示可以利用該報告細胞系追蹤體外造血分化中與成年造血密切相關(guān)的Runx1c的動態(tài)表達。

A：誘導(dǎo)hPSC產(chǎn)生早期HPC的策略圖；B：H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系在造血分化不同階段表達Runx1c的情況圖7 利用H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系追蹤成年造血過程Fig.7 Tracking the definitive hematopoiesis by the H1-hESC derived-Runx1c-mNeonGreen reporter cell line

表3 不同單細胞來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系的分化效率Table 3 The differentiation efficiency of different single cell derived-Runx1c-mNeonGreen reporter cell line

3 討論

Runx1是造血發(fā)育中重要的調(diào)節(jié)因子，也是核心結(jié)合因子(core-binding fators，CBF)復(fù)合體的α亞單位，是與人類白血病相關(guān)的最常見的染色體易位部位[13-14]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，Runx1主要與胚胎造血中的成年造血以及HSC的產(chǎn)生有關(guān)[15-17]。已有研究表明，盡管Runx1缺失不影響原始造血以及卵黃囊血管的生成，但是胚胎仍然會在E11.5成年造血發(fā)生的時間點因出血或者缺血而死亡[15-16]。Runx1有不同的啟動子和不同的剪接方式，存在多種亞型，其中，Runx1a和Runx1b由P2啟動子啟動表達，而Runx1c由P1啟動子啟動表達[18-19]。Runx1a和Runx1b在造血發(fā)育的全過程均表達，而Runx1c只在成體HSC出現(xiàn)的時間點表達，而且在所有成體HSC出現(xiàn)的部位均有表達[7]。在hESC的分化中發(fā)現(xiàn)Runx1c的表達平行于其他造血相關(guān)表面標(biāo)志的表達，并且限于CD34+的細胞亞群中[20]。Runx1c是hPSC造血分化中最早上調(diào)表達的亞型，其首先在HE中表達，而其他Runx1亞型在隨后出現(xiàn)的CD45+血細胞中表達。在hESC中組成型表達Runx1c會增加HE和CD45+血細胞的產(chǎn)生，而特異性敲除Runx1c則會影響HE的造血命運特異化[9]。因此，Runx1c亞型對功能性成體造血細胞的產(chǎn)生十分重要。

hPSC是一群具有自我更新和多向分化潛能的干細胞群體，在基礎(chǔ)研究和再生醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景，也是研究體外造血分化的有效工具[21]。對hPSC進行基因編輯為研究基因功能、構(gòu)建疾病模型等提供了可能[22]。CRISPR-Cas9技術(shù)是基因編輯的有力手段[23]，然而大部分的細胞會在電轉(zhuǎn)質(zhì)粒之后死亡，由此造成的基因編輯效率低下的問題限制了CRISPR-Cas9在hPSC中的應(yīng)用[24-25]。BCL-XL是抗凋亡基因家族中的一種，可以維持線粒體外膜的完整性，防止線粒體內(nèi)容物細胞色素c的釋放，促進hPSC的單細胞存活率[26-27]。已有研究表明，通過瞬時過表達BCL-XL可以顯著提高基因編輯效率[25]。另一方面，精準的基因編輯還有賴于雙鏈DNA(double strand DNA，dsDNA)斷裂之后的HDR修復(fù)[23]。針對提高HDR修復(fù)效率的研究發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)粒模板兩側(cè)各加入一段sgRNA的識別序列，質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進入細胞后，Cas9對基因組進行切割的同時也會使質(zhì)粒線性化，可以使HDR效率提高5～10倍以上[8]。

因此，在本研究中，通過雙切質(zhì)粒模板聯(lián)合瞬時轉(zhuǎn)入BCL-XL的CRISPR-Cas9技術(shù)，實現(xiàn)hPSC的高效重編程并成功構(gòu)建了H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系。本研究不僅提高了hPSC重編程效率，而且實現(xiàn)了以HDR形式在Runx1c的1號外顯子處原位插入mNeonGreen報告基因片段。這種雙切質(zhì)粒模板聯(lián)合瞬時轉(zhuǎn)入BCL-XL的新型CRISPR-Cas9基因編輯方法對編輯后hPSC的自我更新和多向分化潛能均不產(chǎn)生影響，染色體核型也正常，所以該技術(shù)能夠在不影響細胞本身特征的情況下實現(xiàn)成功插入基因片段，有利于未來臨床轉(zhuǎn)化。

盡管很多研究發(fā)現(xiàn)Runx1c與胚胎造血發(fā)育中的成年造血密切相關(guān)[15-16]，但是到目前為止沒有報道連續(xù)監(jiān)測過Runx1c在人造血發(fā)育中的表達。因此，本研究首次利用hPSC體外單層逐級造血分化方法[9]，動態(tài)追蹤了Runx1c在人早期造血發(fā)育中的表達。另外，在以往的一些研究中，針對Runx1c和造血的關(guān)系，主要是圍繞HSC和血細胞展開，而不是HSC和血細胞產(chǎn)生的過程，即造血發(fā)育過程[7]。而在本研究中，針對Runx1c在造血發(fā)育過程中的影響進行了探究，發(fā)現(xiàn)Runx1c在HE特化階段表達水平最高，EHT階段表達稍有下降，這提示了Runx1c不僅在血細胞中表達而且對造血命運特化至關(guān)重要。本研究利用H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系主要探究了Runx1c在早期造血發(fā)育中的表達，而對晚期造血發(fā)育尤其是造血譜系特異化的研究還有待進行。此外，本研究主要定位為細胞系構(gòu)建等技術(shù)性研究，重點介紹了如何利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建Runx1-c報告細胞系，尚缺乏后續(xù)的造血譜系及功能驗證，這也以后的工作重點。

綜上所述，本研究利用雙切質(zhì)粒模板聯(lián)合瞬時轉(zhuǎn)入BCL-XL的新型CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細胞系，并追蹤了Runx1c在人早期造血發(fā)育中的動態(tài)表達。本研究有利于闡明成年造血的產(chǎn)生過程，也為體外功能性血細胞的產(chǎn)生提供了可能。