王歡,牛昆,江一帆,董靜

華北制藥新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司, 抗體藥物研制國家重點實驗室, 石家莊 050015

近年來，生物制藥發(fā)展迅速，2019年全球藥物銷售Top10的藥物中有7個為抗體或融合蛋白。在生物藥物研發(fā)過程中，由于存在翻譯后修飾，抗體藥的質(zhì)量控制顯得尤為重要。在研發(fā)人員重點關(guān)注的質(zhì)量屬性中，電荷異質(zhì)性是關(guān)鍵質(zhì)量屬性(critical quality attributes，CQA)之一。電荷異質(zhì)性來源于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，如末端的改變、糖基化[1-2]、脫酰氨基作用[3]、異構(gòu)化、氧化、分裂、聚合等[4]都會引起表面電荷的改變。電荷異構(gòu)體是因電荷改變的修飾后蛋白質(zhì)，可以通過基于電荷差異的純化方法分離出主峰、酸性峰和堿性峰三部分。對應(yīng)酸性峰和堿性峰的，分別是酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)，與主要成分(對應(yīng)主峰)相比，可能對應(yīng)不同的臨床效果。

本文通過綜述重組單克隆抗體產(chǎn)生電荷異質(zhì)性的表征方法、原因及對藥效和安全性的影響，闡述了電荷異質(zhì)性調(diào)控的必要性。通過總結(jié)工藝上下游調(diào)控策略，希望為生物藥物工藝開發(fā)研究提供有關(guān)單抗藥物電荷異質(zhì)性常見問題的解決思路。

1 重組單克隆抗體電荷異質(zhì)性的表征

重組單克隆抗體的電荷異質(zhì)性表征方法主要有等電聚焦電泳(isoelectric focusing, IEF)和離子交換層析(ion exchange, IEX)[5-6]。

等電聚焦電泳(IEF)根據(jù)分子的等電點(pI)和總電荷分離抗體，一般用280 nm處紫外吸收實現(xiàn)檢測。離子交換層析(IEX)是解決電荷異構(gòu)體的另一種主要技術(shù)，由于許多治療性抗體具有堿性pI值，因此陽離子交換層析(cation-exchange,CEX)是最常用的IEX技術(shù)。

重組單克隆抗體可基于以上純化或分析方法分離成酸性成分、主要成分和堿性成分。主要成分在主峰位置出峰；酸性物質(zhì)在IEF低于pI,CEX早于主峰，或AEX晚于主峰；堿性物質(zhì)在IEF高于pI，CEX晚于主峰，或AEX早于主峰。

在抗體藥質(zhì)量表征過程中，還可以使用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)或酶處理加色譜分析的方法對電荷異構(gòu)體形成原因進行進一步的分析[7]。

2 重組單克隆抗體電荷異質(zhì)性產(chǎn)生的蛋白修飾

2.1 主要成分

主要成分的翻譯后修飾一般包括N端的谷氨酰胺環(huán)化成為焦谷氨酸、去除重鏈C端的賴氨酸、CH2區(qū)域Asn鏈接的糖型為中性。

2.1.1N端的谷氨酰胺環(huán)化成為焦谷氨酸 有些抗體的重、輕鏈N端第一個氨基酸為谷氨酰胺，該谷氨酰胺通常會以焦谷氨酸環(huán)化形式存在。帶有焦谷氨酸環(huán)化的抗體，會在主峰洗脫[8]，未發(fā)生環(huán)化的谷氨酰胺在堿性峰洗脫。

2.1.2去除重鏈C端的賴氨酸 羧肽酶去除重鏈C端賴氨酸，使抗體存在0、1或2個賴氨酸。沒有C端賴氨酸的抗體在主峰洗脫，但也存在有兩個C端賴氨酸的抗體出現(xiàn)在主峰的報道[8]。

2.1.3CH2區(qū)域Asn鏈接的糖型為中性 在CH2區(qū)域保守的Asn297有對稱的N連接的低聚糖。哺乳動物細胞培養(yǎng)表達的重組抗體的主要糖型為有或無核心巖藻糖的雙天線結(jié)構(gòu)，有1、2個或沒有末端的半乳糖殘基[9]。

2.2 酸性物質(zhì)的蛋白修飾

抗體唾液酸修飾和天冬氨酰(Asn)脫酰胺是產(chǎn)生酸性物質(zhì)的主要原因[8，10]，前者已經(jīng)被廣泛報道，形成的原因在于唾液酸本身存在的陰離子[11]。后者通過引入陰離子導(dǎo)致酸性物質(zhì)的出現(xiàn)，常發(fā)生在抗體可變區(qū)，尤其發(fā)生在暴露和容易發(fā)生形變的CDR(互補決定區(qū))區(qū)域[11-12]，結(jié)果是產(chǎn)生天冬氨酸(Asp)或異天冬氨酸(isoAsp)，且CDR區(qū)域的柔性會導(dǎo)致抗體不同CDR之間發(fā)生相互影響[13]。

除此之外，還存在其他造成酸性物質(zhì)產(chǎn)生的原因，如：還原糖醛基與側(cè)鏈或N端的賴氨酸、組氨酸或精氨酸等氨基酸的氨基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[14]；非典型二硫鍵連接[15]；抗體含有三硫鍵或高甘露糖成分[16-17]；馬來酸修飾重鏈和輕鏈N端氨基而產(chǎn)生酸性物質(zhì)；重組抗體重鏈CDR3的Cys104可能發(fā)生半胱酰胺化反應(yīng)[18]；抗體具有還原二硫鍵[14]或者非還原成分以及一系列抗體裂解碎片等[17,19]。

2.3 堿性物質(zhì)的蛋白修飾

抗體產(chǎn)生堿性物質(zhì)的主要原因是C端賴氨酸的去除和天冬氨酸的異構(gòu)化?？贵wC端賴氨酸的去除是被報道最多的形成堿性物質(zhì)的原因[8,20-21]，這是由于羧肽酶B切除C端賴氨酸不徹底從而形成堿性物質(zhì)。琥珀酰亞胺(Asu)是天冬氨酸(Asp)異構(gòu)化的常見中間產(chǎn)物，Asu的產(chǎn)生也是形成堿性物質(zhì)的主要原因，但Asu也可能通過蛋白質(zhì)構(gòu)象的明顯改變而產(chǎn)生酸性物質(zhì)[22]。

其他造成堿性物質(zhì)產(chǎn)生的原因，如：N端谷氨酰胺環(huán)化成焦谷氨酸時，環(huán)化作用不完全導(dǎo)致形成含有最初谷氨酰胺的抗體；溫度及光照均會導(dǎo)致甲硫氨酸氧化，進而通過影響臨近氨基酸電離程度導(dǎo)致堿性物質(zhì)的出現(xiàn)[11]；抗體重鏈C端序列為脯氨酸-甘氨酸-賴氨酸(PGK)時，末位賴氨酸被切除后導(dǎo)致脯氨酸酰胺化[23]；重鏈可變區(qū)有未成形的二硫鍵[24]抗體信號肽的不完全去除[8，14],重組單抗輕鏈絲氨酸到精氨酸或發(fā)生在重鏈Fc區(qū)域的氨基酸突變[10]；含有一個糖基化修飾的重鏈和一個具有短寡糖重鏈的抗體在CEX作為堿性物質(zhì)洗脫[25]；非共價的Fab-Fab二聚體[26]；抗體的聚體[14,26]和碎片[19]等。常見的能夠?qū)е码姾僧愘|(zhì)性產(chǎn)生的抗體修飾見圖1。

圖1 導(dǎo)致電荷異質(zhì)性的抗體修飾[27]Fig.1 Modification of antibodies that cause charge heterogeneity[27]

3 產(chǎn)品安全性和有效性的影響

報道指出，減少酸性物質(zhì)比減少堿性物質(zhì)更為重要[28-29]。相比于堿性物質(zhì)，酸性物質(zhì)會造成單抗藥物體內(nèi)滯留時間減少和血液清除率加快，且對藥效不利，如曲妥珠單抗的酸性變異體與HER2的結(jié)合能力較低[30]。堿性物質(zhì)多對藥效產(chǎn)生正面影響，如在很多情況下，堿性變異體顯示出更強的親和力及更強的ADCC效應(yīng)。但一般認為等電點(pI)差異大于1的蛋白產(chǎn)品在組織分布和代謝動力學(xué)方面會產(chǎn)生較大的差異[31]。

導(dǎo)致電荷異質(zhì)性產(chǎn)生的各種修飾對抗體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和生物功能的潛在影響在很大程度上取決于它們的修飾位置。N端或C端的抗體修飾，如賴氨酸的去除和谷氨酰胺的焦谷氨酸環(huán)化一般不會對抗體的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性產(chǎn)生實質(zhì)影響，也不會影響抗體的CDC及ADCC效應(yīng)[21]，因為這些位置高度暴露，不是任何配體結(jié)合位點的一部分。在N端、C端以外區(qū)域的修飾更可能對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和生物功能產(chǎn)生實質(zhì)性的影響[13]。CDR區(qū)天冬酰胺脫氨基作用會導(dǎo)致重組抗體-抗原結(jié)合力下降，原因可能是因為脫氨基作用導(dǎo)致抗體-抗原不能結(jié)合或親和力下降[13，17]；同樣，由天冬酰胺脫氨基作用導(dǎo)致的蛋白異天冬氨酸化可能使蛋白原有氫鍵被打破及CDR區(qū)域柔性下降[13]。重鏈CDR3區(qū)域Cys104的半胱酰胺化導(dǎo)致抗體熱穩(wěn)定性下降，更容易形成聚集物。非經(jīng)典二硫鍵的作用因抗體而異，在效價測定中，IgG2B的效價與IgG2A相同或更低[32]。同時研究報道，鉸鏈區(qū)存在三硫鍵不影響IgG2抗體的熱穩(wěn)定性[16]。

一般認為唾液酸不會對抗體的效價造成影響。而Fc區(qū)臨近于多個配體結(jié)合位點的Met殘基氧化可以減少protein A、protein G和FcRn結(jié)合性，但對Fcγ受體結(jié)合影響很小[33-34]。此外，Met殘基的氧化導(dǎo)致了體內(nèi)半衰期的顯著降低[35]及抗體熱穩(wěn)定性下降[36]，并增加了形成聚體的傾向[37]。

上文提到的修飾對抗體結(jié)構(gòu)和功能的影響，但需要評估總的電荷異質(zhì)性帶來的復(fù)合影響。一個IgG1單抗的修飾可能輕微影響抗原結(jié)合，但可能不影響藥效和體內(nèi)PK，對于質(zhì)量研究人員來說，同時收集相應(yīng)的組分展開研究是有必要的。

4 重組單克隆抗體電荷異質(zhì)性的工藝調(diào)控

4.1 上游調(diào)控策略

在抗體研發(fā)上游階段存在多種手段對抗體電荷異質(zhì)性進行調(diào)控(表1)，基因組學(xué)的方法成功解決了很多關(guān)于產(chǎn)品表達和質(zhì)量的問題，如通過改變酶活性來達到唾液酸修飾調(diào)節(jié)的目的，從而控制產(chǎn)品的電荷；對羧基肽酶活性的研究也成功通過調(diào)控C端氨基酸殘基缺失控制抗體基本電荷的變化[41-42]。

但是許多電荷變異修飾是由于細胞外相互作用以分子依賴的方式發(fā)生的，很難預(yù)測和控制。因此培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)基的控制是調(diào)節(jié)電荷異質(zhì)性的常用方法。

大量參數(shù)都會對堿性峰造成影響，包括溫度、pH、溶氧和接種密度。其中pH影響較大，被認為是關(guān)鍵參數(shù)[43-45]，如隨著pH的增加，天冬酰胺脫氨基反應(yīng)速率也明顯增加[13]；但溫度是唯一可以顯著降低酸峰的參數(shù)，原因可能在于降溫可以降低羧基肽酶B的轉(zhuǎn)錄水平，增加賴氨酸變異體數(shù)量，從而減少酸性物質(zhì)的形成。

培養(yǎng)基成分對電荷有著重要影響，在化學(xué)成分限定培養(yǎng)基中，銅離子濃度升高，鋅離子濃度降低，抗體C末端賴氨酸變異體會增加；增加丙三醇、氯化鈉和金屬離子濃度，抗體脫酰胺作用會增加；丁酸鈉雖然增加抗體表達量，但電荷異質(zhì)性也會增加，特別是堿性物質(zhì)；生物類黃酮家族物質(zhì)會減少抗體的酸性物質(zhì)；硫代硫酸鹽會與抗體反應(yīng)形成酸性物質(zhì)。

4.2 下游調(diào)控策略

離子交換層析(IEX)是分離電荷變異體的首選純化技術(shù)，分離方法一般圍繞樹脂的選擇和洗脫方式的優(yōu)化(通常是鹽濃度和pH梯度)[40,46]。固定相的設(shè)計需要滿足行業(yè)內(nèi)規(guī)范，色譜層析柱需要根據(jù)目的蛋白的載量和蛋白結(jié)合力進行選擇。

膜層析主要用于分離電荷變異體[47]、聚體[48]和宿主細胞蛋白[49]。其主要限制因素在于結(jié)合能力較低。目前，提高結(jié)合能力有助于膜層析技術(shù)廣泛應(yīng)用于電荷變異體分離。

表1 抗體電荷異質(zhì)性上游調(diào)控手段[38-40]Table 1 Upstream regulation of antibody charge heterogeneity[38-40]

混合模式色譜允許在高鹽濃度、高載量、寬操作窗口和高選擇性條件下操作，能夠?qū)㈦姾勺凅w雜質(zhì)分離成單獨的峰[50]。但由于成本高、優(yōu)化過程復(fù)雜，且應(yīng)用集中在解決聚體問題[51-52]，因此一般作為備選方案。

洗脫模式的設(shè)計有很強的靈活性，通常有兩種洗脫方式調(diào)控電荷異質(zhì)性：鹽濃度梯度洗脫和pH梯度洗脫。前者是最常見的洗脫方式[53]，通過帶電荷的鹽離子與結(jié)合蛋白以濃度依賴的方式競爭樹脂的官能團；后者利用在離子強度，蛋白質(zhì)等電點(pI)附近的pH，在AEX模式下，高于蛋白等電點，而CEX模式下，低于等電點。工業(yè)操作可以實現(xiàn)逐級鹽或pH梯度。然而，這種策略可能會增加操作周期的總數(shù)和整個單元的操作時間，從而增加成本[54]。

由于生產(chǎn)規(guī)模的產(chǎn)能限制，利用純化手段分離電荷變體的能力仍然有限。更深刻地理解對蛋白質(zhì)結(jié)合和緩沖液相互作用和建立模型，將會大大改善下游過程的電荷變化控制，減少過度依賴大型DOE，以確定整個純化工藝。

5 討論

目前已知的蛋白質(zhì)翻譯后修飾超過300種，其中很多修飾可能影響蛋白的功能和性質(zhì)，但只有少數(shù)翻譯后修飾研究比較深入。翻譯后修飾造成的電荷異質(zhì)性可能會影響藥效及造成意外的副作用，因此保持電荷一致性是非常重要的。但是，由于目前對電荷變化原因的理解仍然不足，因此關(guān)于電荷異質(zhì)性的調(diào)控方法雖有陸續(xù)報道，但由于相對復(fù)雜，即使確定產(chǎn)生原因，成功調(diào)控到理想的范圍也可能十分困難。因此單抗藥物電荷異質(zhì)性的調(diào)控是一個關(guān)鍵的挑戰(zhàn)，其研究應(yīng)貫穿整個生物藥物的開發(fā)階段，包括細胞株的構(gòu)建和確定、細胞培養(yǎng)工藝、收獲、純化和分析表征。

對于質(zhì)量研究人員來說，需要根據(jù)項目的特點應(yīng)用適宜的技術(shù)對于抗體電荷異質(zhì)性產(chǎn)生原因的表征并進行深入研究。工藝開發(fā)人員需要根據(jù)質(zhì)量人員的研究結(jié)果反饋，選擇是否需要采用工藝等手段對電荷異質(zhì)性進行調(diào)節(jié)。

整個培養(yǎng)工藝優(yōu)化過程，一般是先確定培養(yǎng)基，通過確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基對補料進行調(diào)整來調(diào)整關(guān)鍵質(zhì)量屬性，也可以確定補料對基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行混合或替換，或者通過簡單的梯度實驗找到關(guān)鍵工藝參數(shù)然后重點研究，再根據(jù)項目特點選擇是否需要進行交互作用研究的實驗。在這些工作完成以后可以根據(jù)質(zhì)量結(jié)果進行分析，再有的放矢的進行調(diào)節(jié)。

工藝部門需要質(zhì)量部門的協(xié)助，正確的對生物藥進行表征會使工藝開發(fā)過程有明確的方向性。什么時候進行質(zhì)量分析以及分析的程度是一個值得思考的問題，一方面，質(zhì)量研究開展的越早越好，研究深度越深越好，但相應(yīng)的成本也越高，周期也越長。另一方面前期較少的樣本量無法支持質(zhì)量分析，加上酸堿峰成分的表征方法也相對復(fù)雜，需要根據(jù)經(jīng)驗進行，一般要做多輪次實驗，很難做到快速檢測，所以前期開發(fā)主要還是使用離子色譜等手段，根據(jù)項目的推進，逐步開展深度的工藝表征。