(太原市第四人民醫(yī)院，山西 太原 030053)

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法快速診斷肺結(jié)核的臨床評價

郗志華

(太原市第四人民醫(yī)院，山西 太原 030053)

目的探討環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法在肺結(jié)核診斷中的價值。方法回顧性分析36例痰結(jié)核菌培養(yǎng)陽性患者，比較涂片抗酸染色法、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法的陽性率。結(jié)果環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法的陽性率77.78%，涂片抗酸染色法的陽性率52.78%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；涂陽培陽，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法的陽性率94.73%；涂陰培陽，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法的陽性率58.82%。結(jié)論環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法在肺結(jié)核診斷中有重要價值。

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法；結(jié)核分枝桿菌；肺結(jié)核

細菌學(xué)檢查是診斷結(jié)核病的金標準，是結(jié)核病診斷和化療的重要依據(jù)。但由于傳統(tǒng)涂片敏感性低，培養(yǎng)所需時間長等原因，致使病原學(xué)檢查一直不能滿足臨床診治的需求，誤診和誤治時有發(fā)生，影響了治療效果，加重患者心理和經(jīng)濟負擔，也使得疾病易于傳播。因此，早期、準確和快速的診斷技術(shù)是控制全球結(jié)核病的關(guān)鍵。

近年發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，是由Notomi等[1]設(shè)計用于病原微生物的檢測，該技術(shù)不需要昂貴儀器設(shè)備，操作簡單，價格適中。給結(jié)核病的快速診斷帶來了希望?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10～11月于太原市第四人民醫(yī)院就診的疑似肺結(jié)核患者，痰結(jié)核菌培養(yǎng)確診36例，男20例，女16例；年齡17～81歲，平均(42.3±3.1)歲。

1.2 試劑與儀器

二級生物安全柜(海爾)，抗酸染液，BACTEC MGITBD960液體快速培養(yǎng)(美國BD公司)， 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑(恒溫擴增法，廣州迪奧生物科技有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 涂片抗酸染色 用竹簽挑取膿性痰液在玻片2/3處涂抹均勻，面積為1 cm×2 cm，行抗酸染色，鏡檢。參照《痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》[2]

1.3.2 BACTEC MGITBD960液體快速培養(yǎng)及羅氏比例法藥敏 吸取2mL痰液，加入2倍的 2%枸櫞酸鈉 半胱氨酸-氫氧化鈉(2%NALC-NaOH)前處理液，旋窩震蕩 20 s。室溫靜置 15～20 min，請勿超過 20 min。加無菌磷酸鹽緩沖液 PBS(pH6.8)至約 40 mL，蓋緊蓋子，3 000 rpm離心 15 min，倒掉上清液。添加 1～3 mL PBS(pH6.8)以中和 pH 至 6.8。取處理后標本 0.5 mL加入準備好的 MGIT 培養(yǎng)管培養(yǎng)。參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化程序及質(zhì)量保證手冊》[3]，培養(yǎng)陽性時涂片確認。

1.3.3 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(恒溫擴增法) 在痰液中加入等體積4%NaOH溶液,渦旋振蕩30s，室溫下放置15 min，使其充分液化。取1 mL液化后的痰液至1.5 mL離心管，12 000 rpm離心5 min，棄上清。沉淀用1 mL滅菌生理鹽水懸浮，12 000 rpm離心5 min，棄上清。向含沉淀物的離心管中加入100μL的DNA提取液，震蕩混勻。100℃恒溫處理10 min。12 000 rpm離心2 min，上清液做為模板備用。將模板DNA和對照品2.0μL分別加入到對應(yīng)的反應(yīng)管中10 000 rpm離心5 s。放入擴增儀編輯開始。

1.4 質(zhì)量控制

所有操作均在安全柜內(nèi)進行，參加國家結(jié)核病實驗室藥敏熟練度測試，以 H37RV標準株作為陽性參照，加以質(zhì)控檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實驗以羅氏培養(yǎng)為金標準，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法的陽性率77.78%(28/36)，涂片抗酸染色法的陽性率52.78%(19/36)；涂陽培陽，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法的陽性率94.73%(18/19)；涂陰培陽，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法的陽性率58.82%(10/17)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.96，P=0.03)。見表1。

表1 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法與涂片抗酸染色法檢測結(jié)果比較

3 討論

近年來，世界衛(wèi)生組織以及其他國際組織對全球結(jié)核病的控制加大了新方法、新化療藥物以及新疫苗研發(fā)的投入力度。據(jù)世界衛(wèi)生組織結(jié)核病控制2009年報告，有許多國家完成并提交了結(jié)核病新診斷方法的實踐報告，部分新診斷方法已進入臨床試驗階段。 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法技術(shù)原理：采用恒溫擴增技術(shù)，通過Bst聚合酶及特異性引物在恒溫條件下對標本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸片段進行特異性擴增，擴增產(chǎn)物(DNA)與核酸染料結(jié)合后發(fā)出熒光信號，根據(jù)儀器給出的擴增曲線和出峰時間判斷結(jié)果，可以快速對人痰標本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群DNA進行定性檢測。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法技術(shù)的優(yōu)勢：a)同涂片抗酸染色相比，肺結(jié)核患者的陽性檢出率提高。b)檢出時間大約需要1 h左右，有利于快速診斷及控制傳染。c)等溫擴增的操作簡單，技術(shù)要求低，同時不需要昂貴的擴增儀器。本研究中以快速培養(yǎng)為金標準，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法陽性率為77.78%低于江勇等[4]，可能原因是：一是標本例數(shù)少，不典型；二是陽性標準不一樣。涂陽培陽，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法的陽性率94.73%；涂陰培陽，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法的陽性率58.82%與戴光明等[5]接近。

本研究顯示，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法優(yōu)于涂片檢測，方法簡便易行、靈敏度高、對檢驗條件要求低等特點，適合于基層實驗室應(yīng)用，在肺結(jié)核診斷中有重要價值。

[1] Notomi T，OkayamaH，MasubuchiH，et a1．Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA[J]．Nucleic Acids Res，2000，15，28(12)：63.

[2] 中國疾病預(yù)防控制中心.痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊[M].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社, 2004.

[3] 趙雁林，王黎霞，成時明，等.分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化程序及質(zhì)量保證手冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2013.

[4] 江 勇，錢 明，陳 濤，等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增對肺結(jié)核快速診斷的分析研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29(23)：3818-3820.

[5] 戴廣明，曹以誠，杜正平，等.結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LANP)快速檢測方法的評價[J].中國防癆雜志，2011，33(1):47-51.

本文編輯：王知平

R446.1

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1671-0126(2017)05-0028-03

郗志華，男，檢驗師，從事臨床檢驗工作