樓志華

摘 要：為了實現(xiàn)麥芽三糖酶的商業(yè)化生產(chǎn)，本研究以枯草芽孢桿菌為宿主，構(gòu)建了木糖誘導(dǎo)分泌表達載體，表達了來源于Thermobifida fusca NTU22的麥芽三糖酶基因，考察重組枯草芽孢桿菌表達麥芽三糖酶的能力。搖瓶驗證了基因的功能表達之后，經(jīng)過初步優(yōu)化，最大發(fā)酵酶活為（108.4±2.84）U·mL-1。該研究為重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)麥芽三糖酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了參考。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌;麥芽三糖酶;分泌表達

Abstract：In order to realize the commercial production of maltotriohydrolase， in this study， Bacillus subtilis was used as the host to construct a xylose-inducing secretion expression vector and express the maltotriohydrolase gene derived from Thermobifida fusca NTU22. The ability of recombinant Bacillus subtilis to express maltotriase was investigated. After the shake flask verified the functional expression of the gene， after preliminary optimization， the maximum fermentation enzyme activity was （108.4±2.84） U·mL-1. This research provides a reference for the industrial application of recombinant maltotriase produced by Bacillus subtilis fermentation.

Key words：Bacillus subtilis; Maltotriohydrolase; Secreted expression

中圖分類號：TQ925.1

麥芽三糖酶（Glucan 1，4-alpha-maltotriohydrolase），也叫麥芽三糖淀粉水解酶，可以從淀粉多糖的非還原末端連續(xù)地切割麥芽三糖殘基，其主要水解產(chǎn)物麥芽三糖在糖果行業(yè)、飲料行業(yè)、食品加工行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[1]。目前，研究發(fā)現(xiàn)的麥芽三糖酶基因主要來源于蛾微桿菌（Microbacterium imperiale）[2]、灰鏈霉菌（Streptomyces griseus）[3]等，然而對于如何實現(xiàn)該酶的規(guī)模化、商業(yè)化生產(chǎn)鮮見報道。因此，麥芽三糖酶的高效生產(chǎn)菌種亟待開發(fā)，以實現(xiàn)麥芽三糖規(guī)模生產(chǎn)。

枯草芽孢桿菌是美國食品和藥品管理局、中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認證的食品安全菌株，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)各種工業(yè)酶制劑[4-5]。本研究擬構(gòu)建木糖誘導(dǎo)的枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)，對來源于Thermobifida fusca NTU22的麥芽三糖酶基因序列優(yōu)化后進行異源分泌表達，并對構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵條件優(yōu)化，為枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)麥芽三糖酶的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

敲除了α-淀粉酶基因amyL的枯草芽孢桿菌模式菌株Bacillus subtilis WB600、E. coli JM109、E. coli JM109/pBSxyl、E. coli JM109/pBSG3，均購于江南大學(xué)。

1.2 工具酶、引物和試劑

Taq和Pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購于Thermo Fisher公司，各種限制性內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于TAKARA有限公司。

1.3 DNA操作技術(shù)

質(zhì)粒提取、DNA片段純化、回收等均參照TAKARA試劑盒說明書，PCR擴增反應(yīng)、DNA瓊脂糖凝膠電泳、酶切、連接以及轉(zhuǎn)化子篩選等均參照分子克隆實驗指南[6]。

1.4 重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

LBY培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)E. coli JM109/pBSxyl、E. coli JM109/pBSG3，提取重組質(zhì)粒pBSxyl、pBSG3后，按文獻[7]所述方法將其轉(zhuǎn)入敲除了α-淀粉酶基因amyL的B. subtilis WB600，從而獲得重組枯草芽孢桿菌，分別命名為BSXYL和BSG3。

1.5 麥芽三糖酶酶活定義及測定

麥芽三糖酶酶活檢測方法參考文獻[8]。酶活單位（U）定義為：在pH 6.0、55 ℃的反應(yīng)條件下，每分鐘水解1%可溶性淀粉生成相當(dāng)于1 μmoL麥芽三糖所需的酶量。

1.6 發(fā)酵優(yōu)化實驗

LBY培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基以及微量元素配制方法參照文獻[9]。在進行發(fā)酵優(yōu)化實驗時，均使用擋板搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵時均加入終濃度為20 mg·L-1的四環(huán)素。初始pH為7.0，溫度37 ℃，在適當(dāng)時間添加木糖進行誘導(dǎo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達載體的構(gòu)建

NCBI顯示，Thermobifida fusca NTU22來源的麥芽三糖酶基因序列總長為1818 bp，含木糖異構(gòu)酶啟動子及其調(diào)控蛋白基因、信號肽的基因片段長度約為1507 bp。重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和KpnⅠ酶切后應(yīng)獲得大小為1522 bp和6789 bp的兩條核酸條帶，電泳鑒定結(jié)果符合預(yù)期（圖1），結(jié)合測序結(jié)果，表明重組表達載體構(gòu)建正確。

2.2 重組麥芽三糖酶的表達

將對照菌BSXYL和重組表達菌株BSG3分別進行搖瓶發(fā)酵，接種后8 h均加入10 g·L-1木糖進行誘導(dǎo)，然后繼續(xù)培養(yǎng)30 h，離心后收集發(fā)酵液上清，分別檢測二者胞外麥芽三糖酶活力。結(jié)果顯示，只有重組表達菌株BSG3檢測到活力，而對照菌BSXYL未檢測到活力。蛋白電泳（圖2）結(jié)果顯示在約68.7 kDa處出現(xiàn)一明顯的表達條帶，表明枯草芽孢桿菌成功地分泌了麥芽三糖酶到發(fā)酵液中[10-11]。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)劑添加時間對發(fā)酵的影響

分別在發(fā)酵培養(yǎng)至4、8、12、16 h添加10 g·L-1木糖進行誘導(dǎo)，然后繼續(xù)發(fā)酵至48 h結(jié)束，誘導(dǎo)劑不同添加時間對重組菌表達麥芽三糖酶的影響如圖3所示。

如圖3所示，發(fā)酵結(jié)束時，OD600基本隨著誘導(dǎo)劑添加時間的延遲而增加，這表明添加誘導(dǎo)劑的時間越早，越不利于重組菌的生長。而且在4～12 h，誘導(dǎo)劑添加越晚，發(fā)酵結(jié)束時檢測到的胞外酶活也越高，當(dāng)發(fā)酵12 h添加誘導(dǎo)劑時，發(fā)酵結(jié)束時可以檢測到最高的胞外酶活（69.2±1.67）U·mL-1。

2.3.2 誘導(dǎo)溫度對發(fā)酵的影響

分別考察25、30、37、42 ℃誘導(dǎo)對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，在25～37 ℃，隨著誘導(dǎo)溫度升高，發(fā)酵結(jié)束后的菌體量也越來越高，而42 ℃時，菌體量又有所降低，這說明重組菌最適生長溫度為37 ℃。同時，在25～37 ℃，隨著誘導(dǎo)溫度升高，胞外酶活力逐漸增加，誘導(dǎo)溫度37 ℃時，檢測到最高胞外酶活力可達（71.6±2.31）U·mL-1。

2.3.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響

在前述實驗結(jié)果基礎(chǔ)上進行發(fā)酵，當(dāng)培養(yǎng)至12 h時，添加10 g·L-1木糖進行誘導(dǎo)，同時添加20 g·L-1麥芽糊精，發(fā)酵至24 h時補加20 g·L-1葡萄糖，發(fā)酵至36 h時添加20 g·L-1葡萄糖和10 g·L-1木糖，以后每隔12 h補加10 g·L-1葡萄糖，繼續(xù)發(fā)酵至96 h結(jié)束發(fā)酵。誘導(dǎo)后，每隔12 h檢測菌體量OD600和麥芽三糖酶酶活，結(jié)果如圖5顯示?？梢钥吹?，發(fā)酵至72 h時，胞外檢測到的最大酶活為（108.4±2.84）U·mL-1，之后酶活力明顯開始下降，表明重組菌發(fā)酵應(yīng)在其穩(wěn)定期結(jié)束時停止發(fā)酵。

3 結(jié)論

本研究以枯草芽孢桿菌為宿主，研究了來源于Thermobifida fusca NTU22麥芽三糖基因的表達方法，并且成功地實現(xiàn)了該酶的木糖誘導(dǎo)分泌表達，能夠在發(fā)酵液上清中檢測到酶活力，而且所表達蛋白大小符合理論值。對重組菌進行了發(fā)酵條件優(yōu)化，獲得了最佳的發(fā)酵條件：在對數(shù)生長前中期添加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度37 ℃，發(fā)酵至穩(wěn)定期結(jié)束停止發(fā)酵，胞外檢測到的最大酶活為（108.4±2.84）U·mL-1。

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