何旭華 闞歡 黃陸繄 張娟 劉燦 劉云

摘 要：本研究采用超聲波輔助乙醇提取云南核桃分心木黃酮，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝條件。選取AB-8大孔樹脂對黃酮提取液進(jìn)行純化，并研究了純化后黃酮提取液的抗氧化活性。結(jié)果表明，在乙醇濃度50%、料液比1∶50 g·mL-1和超聲時間12 min時，黃酮得率為7.15%，純度為48.35%?？寡趸钚栽囼?yàn)中，黃酮濃度為2.5 mg·mL-1時，DPPH和ABTS自由基清除率分別達(dá)到90.68%和60.24%，鐵離子還原力吸光值為0.456，即云南核桃分心木黃酮有較強(qiáng)的抗氧化性活性。

關(guān)鍵詞：云南核桃;分心木;黃酮;提取工藝;純化;抗氧化性

Abstract：The flavonoids of distracted wood from Juglans sigilata was extraction by ultrasound， and the extraction process was optimized by orthogonal experiment. AB-8 macroporous resin was selected to purification the flavonoids， and the antioxidant activity of the flavonoids was determined. The results show that the ethanol concentration 50%， the ratio of material to liquid 1∶50 g·mL-1， and ultrasonic time 12 min， the yield of flavonoids was 7.15% and the purity was 48.35%. In the antioxidant activity test， when the concentration of flavonoids was 2.5 mg·mL-1， the free radical scavenging rates of DPPH and ABTS reach 90.68% and 60.24%， respectively， and the absorption value of iron ion reducing power was 0.456， so the flavonoids of distracted wood have strong antioxidant activity.

Key words：Juglans sigilata; Distracted wood; Flavonoids; Extraction process; Purification; Antioxidant

中圖分類號：R284

云南核桃（Juglans sigilata）分心木，是胡桃科（Jualandaceae）核桃屬（Juglans）植物核桃果仁之間的干燥木質(zhì)隔膜，又稱胡桃隔、胡桃夾、胡桃衣等，占核桃質(zhì)量的4%～5%。核桃分心木體輕質(zhì)脆且易折斷，顏色呈棕色或淺棕褐色[1-2]，味道苦澀、食性平和。新疆少數(shù)民族醫(yī)學(xué)記載，分心木可改善體寒、腎虛的生理虛弱，且治療多夢、遺精、遺尿、尿血、泄痢、牙齦出血、帶下和口腔潰瘍等多種疾病[3-4]。研究表明，核桃分心木富含多種生物活性成分，包括黃酮、有機(jī)酸、酚類、生物堿、油脂、皂苷、揮發(fā)油、氨基酸、鞣質(zhì)、糖類、多肽及其他微量化合物，其中黃酮類化合物含量較高[5-9]。

黃酮類物質(zhì)廣泛存在植物中，是以α-苯基苯并吡喃酮為主體的一系列物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用在食品添加劑和治療疾病方面，它能抑制人體產(chǎn)生有害的自由基，也能清除多余的自由基，可延緩衰老、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病和癌癥[10]。相關(guān)研究表明，核桃分心木的水提液或醇提液能抗菌，所含黃酮皂苷物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化效果，可改善小鼠的腎陽虛病癥[11-13]。云南省作為全國最大的核桃生產(chǎn)基地，也是深紋核桃的原產(chǎn)地和高產(chǎn)區(qū)，其核桃具有種源獨(dú)特、品質(zhì)好、產(chǎn)量高、產(chǎn)值高、營養(yǎng)豐富、味道醇香等優(yōu)點(diǎn)，深受大眾歡迎[14-15]。分心木作為核桃副產(chǎn)物，開發(fā)利用不足，其有一定的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，富含多種營養(yǎng)成分。研究其抗氧化性能，以治療疾病和開發(fā)天然的抗氧劑。

本文研究云南核桃分心木中黃酮的提取及工藝優(yōu)化，并初步純化黃酮提取液，考察純化液對DPPH、ABTS自由基清除，以及鐵離子還原力的抗氧化活性。為深入研究和開發(fā)利用核桃分心木提供參考依據(jù)，同時提高云南核桃副產(chǎn)物經(jīng)濟(jì)收益和資源利用率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核桃分心木，云南磨漿農(nóng)業(yè)有限公司提供。AB-8大孔樹脂，購自安徽三星樹脂科技有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海源葉科技有限公司;1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、無水乙醇（99.7%）、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、六水合三氯化鐵，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

UV-2600紫外可見分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司生產(chǎn);YB-250A型高速多功能粉碎機(jī)，永康市速峰工貿(mào)有限公司生產(chǎn);SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵，上海力辰邦西儀器科技有限公司生產(chǎn)：SB25-12DTDS超聲波清洗機(jī)，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司生產(chǎn);KH20R-Ⅱ臺式冷凍高速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);2.5 L型冷凍干燥機(jī)，LABCONCO公司生產(chǎn);RV3V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn);DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn);DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[16]，方法稍做改動。精密稱量10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于30%乙醇并定容至100 mL。以0.1 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為母液，按濃度梯度分別配制濃度為0.000、0.005、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070 mg·mL-1和0.080 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，分別加入0.3 mL 5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaNO2和10%Al（NO3）3，再加入4 mL 4%NaOH，每次加液間隔6 min，最后用30%乙醇定容至10 mL。均勻混合靜置15 min，510 nm處測定樣品吸光值，每組平行測定3次。

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品吸光值（Y）對蘆丁濃度（X）進(jìn)行回歸分析，回歸方程為Y=5.356 6X+0.086 6，R2=0.999 44，具有良好的線性關(guān)系，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較強(qiáng)的可靠性。所得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2.2 總黃酮提取及測定

核桃分心木預(yù)處理：將云南核桃分心木分揀，清洗，鋪于不銹鋼托盤置50 ℃恒溫干燥箱，干脆后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過80目篩保存于密封袋。

稱1 g核桃分心木，用一定濃度乙醇溶解并置超聲波中輔助提取，抽濾得黃酮粗提液，定容至50 mL，備用。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方案，取0.6 mL備用液于10 mL容量瓶測定分心木黃酮吸光值，將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出黃酮濃度，利用得率方程（1）算出黃酮含量。

式（1）中，C-黃酮濃度，g·mL-1;V-黃酮提取液總體積，mL;M-分心木質(zhì)量，g。

2.3 單因素試驗(yàn)

選取乙醇濃度、料液比、超聲時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分析3個因素對黃酮得率的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化單因素對核桃分心木黃酮提取的影響，確定最優(yōu)方案。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2。

2.5 核桃分心木黃酮分離純化試驗(yàn)

最優(yōu)工藝下，稱20 g分心木超聲提取，抽濾，旋蒸濃縮，用型號為AB-8的大孔樹脂以樣液每3 s一滴進(jìn)行洗脫純化，按2.2方法測定純化液黃酮含量，冷凍干燥得黃酮干重，按公式（2）計(jì)算黃酮純度。

式（2）中，m-黃酮粗提物質(zhì)量，g;M-純化后分心木黃酮干重，g。

2.6 核桃分心木黃酮抗氧化性研究

2.6.1 DPPH自由基清除率的測定

用棕色容量瓶配制一定濃度的DPPH-乙醇溶液，參考Cheng等的方法[17]，適當(dāng)調(diào)整。分別取樣品、DPPH-乙醇溶液2 mL于10 mL離心管，避光，37 ℃水浴30 min。在517 nm處測吸光值A(chǔ)1，無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液測吸光值A(chǔ)2，無水乙醇代替樣品液測吸光值A(chǔ)0，平行測3次，取平均值。按公式（3）計(jì)算DPPH自由基的清除率（RSA表示自由基清除活性）。

式（3）中，A0-空白吸光值，A1-樣品吸光值，A2-無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液吸光值。

2.6.2 ABTS自由基清除率的測定

參照文獻(xiàn)[18]改進(jìn)方案，將7 mmol·L-1 ABTS自由基與140 mmol·L-1過硫酸鉀溶液于棕色容量瓶中等體積混合，靜置反應(yīng)12 h，即得ABTS自由基反應(yīng)液。在734 nm處用無水乙醇稀釋ABTS自由基反應(yīng)液吸光值至0.700±0.02，避光現(xiàn)用。取2 mL樣品溶液，2 mL ABTS自由基反應(yīng)液于10 mL離心管，混合搖勻10 s，靜置6 min后，于734 nm處測吸光值A(chǔ)1，樣品用無水乙醇代替測吸光值A(chǔ)0，平行測定3次，取平均值。按公式（4）計(jì)算ABTS自由基的清除率：

2.6.3 鐵離子還原力的測定

參照高行恩等[19-20]的方法適當(dāng)調(diào)整，取2.0 mL樣液于10 mL離心管，加入5 mL 0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）和5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴反應(yīng)30 min，降至室溫后，加入5 mL 10%三氯乙酸，4 000 r·min-1離心10 min。分別取5 mL離心管上清液、蒸餾水和0.1%三氯化鐵，均勻混合靜置10 min，700 nm處測吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1.1 乙醇濃度對云南核桃分心木黃酮得率的影響

乙醇濃度對云南核桃分心木黃酮得率的影響如圖2所示。由圖2可知，黃酮得率隨乙醇濃度的增大呈先增大后急劇減小趨勢，當(dāng)濃度為40%時達(dá)到最大值3.38%。黃酮類化合物因結(jié)構(gòu)不同而呈現(xiàn)不同的極性，依據(jù)相似相溶原理，極性越大提取物的雜質(zhì)越多，黃酮得率越小;極性越小黃酮溶出量越少，得率越小。因此，選取40%乙醇時，黃酮得率最大。

3.1.2 料液比對云南核桃分心木黃酮得率的影響

料液比對云南核桃分心木黃酮得率的影響如圖3所示。由圖3可知，核桃分心木黃酮得率隨料液比增加呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)料液比為1∶70 g·mL-1時，核桃分心木黃酮的得率最大，其最大得率為2.80%。溶劑對分心木中的黃酮具有擴(kuò)散作用，且溶劑體積越大，對核桃分心木中黃酮的擴(kuò)散作用越大，而分心木中黃酮的擴(kuò)散能力越強(qiáng)，黃酮得率越大。料液比為1∶60 g·mL-1和1∶70 g·mL-1時，黃酮得率相差較小，黃酮濃度接近飽和，考慮到成本及資源合理利用，最終選擇黃酮提取的最佳料液比為1∶60 g·mL-1。

3.1.3 超聲時間對云南核桃分心木黃酮得率的影響

超聲時間對云南核桃分心木黃酮得率的影響如圖4所示。由圖4可知，核桃分心木黃酮得率隨時間呈先增加后減少的趨勢：當(dāng)超聲時間為6～12 min時，得率呈上升趨勢;12～14 min時，呈下降趨勢;超聲時間為12 min時，有最大得率2.93%。核桃分心木中黃酮隨超聲時間延長向提取溶劑擴(kuò)散并達(dá)到溶解平衡，因此提取量不斷增加至最大值;超聲時間越長，黃酮結(jié)構(gòu)越易被破壞和氧化，導(dǎo)致提取量下降。此外，超聲時間延長，會造成能源過度消耗，綜合考慮超聲時間應(yīng)選擇12 min。

3.2 正交試驗(yàn)

單因素基礎(chǔ)上，以黃酮得率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，影響核桃分心木黃酮得率的主次順序?yàn)锽>C>A，最優(yōu)工藝為A3B1C2，即乙醇濃度為50%、料液比1∶50 g·mL-1、時間12 min。

采用方差分析以減小試驗(yàn)誤差，提高試驗(yàn)精準(zhǔn)度，同時分析分心木黃酮提取受各因素影響的程度，見表4。利用顯著性檢驗(yàn)，查表得臨界值F0.01（2，2）=99.00，F(xiàn)0.05（2，2）=19.00，所以對于給定的顯著性水平，由表4可知，F(xiàn)A=26.05>F0.05（2，2），F(xiàn)B=99.19>F0.01（2，2），F(xiàn)C=65.28>F0.05（2，2），通過正交試驗(yàn)方差分析表可得，因素A、C對試驗(yàn)有顯著影響，因素B對試驗(yàn)有非常顯著的影響。

3.3 黃酮粗提物純化

選取最優(yōu)工藝，核桃分心木中黃酮經(jīng)過純化試驗(yàn)后，黃酮純度為48.35%。

3.4 分心木抗氧化活性分析

以3.3純化液為樣品，DPPH、ABTS自由基清除率和鐵離子還原能力為指標(biāo)，進(jìn)行黃酮抗氧化性研究，結(jié)果見表5。

由表5可知，分心木黃酮純化液對DPPH、ABTS自由基和鐵離子均有一定清除效果，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，黃酮濃度與自由基清除率呈正相關(guān)，隨濃度增大而增大。不同黃酮濃度對DPPH和ABTS自由基清除效果不同，濃度在0.5 mg·mL-1，DPPH清除率比ABTS高35.688個百分點(diǎn)，鐵離子還原能力吸光值為0.173。濃度在2.5 mg·mL-1時，DPPH自由基清除率高達(dá)90.681%，對DPPH自由基清除效果較強(qiáng)，對ABTS自由基清除率良好，清除率為60.236%。黃酮濃度在0.5～2.5 mg·mL-1時，吸光值從0.173增長到0.456，分心木黃酮的還原能力較強(qiáng)，抗氧化性較好。

4 結(jié)論

本文運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化云南核桃分心木黃酮提取，試驗(yàn)表明，乙醇濃度50%、料液比1：50 g·mL-1、超聲時間12 min是云南核桃分心木黃酮的最優(yōu)提取方案，得率為7.15%。粗提物經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化，純度為48.35%。純化液對DPPH、ABTS自由基和鐵離子的抗氧化試驗(yàn)表明：云南核桃分心木黃酮有較高的抗氧化性，可制備天然的抗氧化劑，為開發(fā)核桃分心木黃酮藥物奠定基礎(chǔ)。

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