陳鳳霞，楊天偉，李杰慶，劉鴻高，范茂攀*，王元忠

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201 2. 云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100 3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201 4. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200

引 言

云南省地形地貌復(fù)雜，獨特的立體氣候條件使得云南野生菌種類豐富多樣[1]。 野生食用菌備受消費者喜愛，因具有較大的食用價值和經(jīng)濟價值而逐漸國際化[2]。 美味牛肝菌則是世界著名野生食用菌，也被稱為“王者牛肝菌”，其肉質(zhì)細膩、味道鮮美，富含多種功能性物質(zhì)，兼具食藥用價值； 其菌在云南分布廣、產(chǎn)量高，但受地形氣候的影響，不同產(chǎn)地的美味牛肝菌品質(zhì)差異明顯，營養(yǎng)物質(zhì)和化學(xué)成分含量具有差異性[3-4]。 傳統(tǒng)的菇類鑒別方法鑒別野生食用菌，主要以產(chǎn)地、子實體形狀、菌體顏色、氣味以及分泌物來進行區(qū)分，但牛肝菌種類多，種間形態(tài)較為相似，僅憑傳統(tǒng)方法鑒別難以達到預(yù)期效果[5]。 我國是野生菌生產(chǎn)和出口大國，市面上銷售的野生食用菌優(yōu)摻劣、真摻假、中毒等安全問題突出，相關(guān)部門難以管控。 尋找一種準確快速的野生食用菌鑒別方法有重要性意義。

光譜技術(shù)具有低成本、易操作、穩(wěn)定可靠等特點，在食品分析中應(yīng)用較為廣泛。 Giraudo[6]等根據(jù)光譜特征結(jié)合化學(xué)計量學(xué)成功對咖啡豆進行了產(chǎn)地鑒別； 有報道在牛肝菌產(chǎn)地鑒別中使用了電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法與紅外光譜法； Cebi[7]等利用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法對明膠橡皮糖進行分類的效果明顯。 數(shù)據(jù)融合是將多種數(shù)據(jù)信息整合、優(yōu)化從而提高信息的采集能力與可信度[8]。 大多數(shù)單一光譜信息提取可能會因為環(huán)境、儀器等原因?qū)е陆Y(jié)果產(chǎn)生偏差，而數(shù)據(jù)融合結(jié)合光譜技術(shù)則可以解決單一光譜信息的片面性。 Pizarro[9]等使用光譜指紋圖譜結(jié)合PLS-DA的數(shù)據(jù)融合成功對西班牙不同產(chǎn)地特級初榨橄欖油進行了分類。 有研究采用FTIR與UV-Vis結(jié)合中級數(shù)據(jù)融合成功對牛肝菌進行了種類和產(chǎn)地鑒別。 以上研究均采用光譜技術(shù)、數(shù)據(jù)融合等方式對食品進行分類分析并取得了較好的結(jié)果。

本研究采用FTIR-MIR、FTIR-NIR、UV-Vis、元素等多元數(shù)據(jù)融合結(jié)合PLS-DA和SVM模型分類方法，對美味牛肝菌進行產(chǎn)地溯源研究，尋找最佳的產(chǎn)地鑒別方法。 為美味牛肝菌質(zhì)量管控與優(yōu)質(zhì)選擇提供借鑒方法，保護消費者權(quán)益。

1 實驗部分

1.1 材料

不同產(chǎn)地美味牛肝菌樣品詳細采集地點見表1，樣品經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉鴻高教授鑒定為成熟期美味牛肝菌。 采集的樣品用陶瓷刀刮去表面泥土、雜物并用自來水清洗干凈，將樣品的蓋和柄分開切片后置于50 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎后存放于聚乙烯自封袋備用。

1.2 數(shù)據(jù)信息采集

FTIR-MIR： 稱取(1.50±0.20) mg樣品粉末與(100.00±2.00) mg溴化鉀置于瑪瑙研缽中混合研磨后用模具壓成透明薄片。 Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀(Perkin Elmer 公司，USA)采集光譜范圍為4 000～400 cm-1，累計掃描16次，儀器分辨率為4 cm-1。 FTIR-NIR： 取(20.00±0.50) g樣品均勻混合，置于玻璃器皿中壓縮，Antaris Ⅱ型傅里葉變換近紅外光譜儀(Thermo Fisher公司，USA)在波數(shù)為10 000～4 000 cm-1范圍掃描，分辨率為4 cm-1，信號累計掃描64次。 UV-Vis： TU-1901紫外-可見分光光度計預(yù)熱1 h，加入甲醇的石英比色皿進行掃描扣除背景值。 將(100.00±0.20) mg樣品粉末與10 mL甲醇置于試管中進行溶解并超聲40 min采集并截取特征吸收峰光譜范圍200～400 cm-1之間的變量。 元素： 取美味牛肝菌蓋、柄樣品(200.00±0.10) mg與5 mL硝酸和2 mL過氧化氫置于消解罐中加蓋密封，放入微波消解儀，其中升溫時間與保溫時間為5 min、功率為1 500 kW、溫度依次以120，150，170和180 ℃。 消解結(jié)束后轉(zhuǎn)入比色管用超純水進行25 mL定容。 利用相同的方法測茶葉標準物GBW07605與空白樣品。 所用數(shù)據(jù)每個樣品一式三份，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用OMNIC8.0軟件對光譜數(shù)據(jù)進行基線校正和吸光度轉(zhuǎn)換，將光譜數(shù)據(jù)用SIMCA13.0軟件分別進行平滑(Savitzky-Golay)、二階導(dǎo)數(shù)(second derivatives，SD)、標準正態(tài)變換(standard normal variables, SNV)等預(yù)處理。 采用Kennard-Stone算法篩選2/3(83)數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集1/3(41)數(shù)據(jù)作為預(yù)測集。 利用SIMCA13.0與MATLABR2018a分別建立PLS-DA與SVM模型。 通過模型正確率來篩選最佳的產(chǎn)地鑒別結(jié)果。

表1 美味牛肝菌產(chǎn)地來源信息Table 1 The geographical origin information of Boletus edulis

2 結(jié)果與討論

2.1 元素測定方法

茶葉標準物質(zhì)GBW07605元素測定結(jié)果如表2，其中回收率在91%～106%之間，測定值與真實值結(jié)果接近。 表明此方法對美味牛肝菌元素含量的測定準確可靠。

2.2 美味牛肝菌礦質(zhì)元素分析

13個產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋與菌柄礦質(zhì)元素含量范圍如表3所示分別是Ba： 17.50～159.44，15.72～181.98 mg·kg-1； Ca： 104.74～467.72，115.27～571.58 mg·kg-1； Cr： 17.70～524.24，10.09～354.27 mg·kg-1； Cu： 24.03

表2 茶葉標準物GBW07605的元素測定結(jié)果Table 2 The element determination results ofcertified reference material GBW07605

～53.15，15.68～77.93 mg·kg-1； K： 7 142.86～14 701.82，5 636.27～14 279.42 mg·kg-1； Mg： 421.44～976.09，246.24～924.63 mg·kg-1； Na： 17.89～716.17，18.84～887.34 mg·kg-1； Ni： 9.66～60.32，8.98～76.02 mg·kg-1； P： 4 414.57～7 311.13，2 198.33～2 423.69 mg·kg-1； Sr： 2.10～143.60，3.99～176.87 mg·kg-1； V： 4.31～54.09，5.28～60.31 mg·kg-1； Zn： 86.24～165.06，39.90～162.54 mg·kg-1。 美味牛肝菌中富含K，P，Mg，Na和Ca等礦質(zhì)元素。 大部分產(chǎn)地美味牛肝菌礦質(zhì)元素含量菌蓋大于菌柄，除個別產(chǎn)地不同部位元素含量差異明顯外，菌蓋和菌柄之間礦質(zhì)元素含量差異幅度較小。 K在美味牛肝菌中含量最高，其中云南省昆明安寧市八街鎮(zhèn)鳳儀村美味牛肝菌菌蓋K元素已達到14 701.82 mg·kg-1； 其次是P，范圍在2 198.33～7 311.13 mg·kg-1之間，最大值與最小值之間相差3.33倍。 不同產(chǎn)地Cr含量差距較大，云南省楚雄彝族自治州南華縣沙橋鎮(zhèn)美味牛肝菌菌蓋是云南省文山市東山鄉(xiāng)美味牛肝菌菌蓋的29.62倍； 不同產(chǎn)地V含量最大值與最小值也相差13.99倍。 美味牛肝菌相同產(chǎn)地不同部位之間，不同產(chǎn)地相同元素之間存在差異性。 這有可能與美味牛肝菌不同部位富集差異及云南不同的環(huán)境、地形、土壤情況等因素有關(guān)。

表3 美味牛肝菌不同部位礦質(zhì)元素含量(Mean±SD)Table 3 Elements concentrations(Mean±SD)in Cap and Stipe of Boletus edulis

續(xù)表3

2.3 光譜分析

2.4 主成分提取

主成分分析是從數(shù)據(jù)中提取重要的信息，降低數(shù)據(jù)集維數(shù)的思想將多個相互關(guān)聯(lián)的數(shù)值轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標來進行分析[10]。 用SIMCA13.0軟件分別對FTIR-MIR、FTIR-NIR、UV-Vis、元素(蓋)、元素(柄)提取特征值>1和Q2最大時的主成分。 由表4可知，其中FTIR-MIR前16個主成分的平均特征值為7.19，累計貢獻率達到了0.835； UV-Vis前17個主成分的平均特征值為6.52，累計貢獻率為0.667。 提取五種數(shù)據(jù)的主成分并組合為一個新的數(shù)據(jù)矩陣，為中級融合進行預(yù)備工作。

圖1 13個產(chǎn)地美味牛肝菌的FTIR-MIR，F(xiàn)TIR-NIR，UV-Vis平均光譜圖

表4 5種數(shù)據(jù)主成分提取信息Table 4 The 5 data principal componentsextract information

2.5 PLS-DA

PLS-DA是一種有師監(jiān)督的多變量統(tǒng)計分析方法[11]。 模型中參數(shù)校正均方根誤差(RMSEE)、交叉驗證均方根誤差(RMSECV)、預(yù)測均方根誤差(RMSEP)參與校正模型評價，其中RMSEE、RMSECV、RMSEP的值小于1且值越接近0代表模型效果越佳。 在參數(shù)RMSEP小于RMSECV時，可避免過擬合風(fēng)險的出現(xiàn)。 對124個美味牛肝菌樣品的五種數(shù)據(jù)進行PLS-DA分析，如表5所示，經(jīng)過數(shù)據(jù)融合后的產(chǎn)地鑒別效果比單一數(shù)據(jù)鑒別效果更佳。 在單一數(shù)據(jù)PLS-DA分析中，F(xiàn)TIR-MIR光譜的訓(xùn)練集與預(yù)測集分別為97.44%與92.94%，在90.00%以上，高于其他單一數(shù)據(jù)。 其次為UV-Vis，主成分個數(shù)為12，訓(xùn)練集與預(yù)測集為94.12%和76.92%。 FTIR-NIR光譜與元素數(shù)據(jù)的預(yù)測集分別為74.36%和58.97%。 為提高模型的準確性，增加數(shù)據(jù)量，將單一的數(shù)據(jù)矩陣進行組合，形成初級融合。 在初級融合中，訓(xùn)練集和預(yù)測集達到了100.00%和94.87%，顯著性提高了產(chǎn)地鑒別的準確率。 根據(jù)表4對五種數(shù)據(jù)提取具有代表性的主成分并進行中級融合，在中級融合中，訓(xùn)練集和預(yù)測集均可達到100.00%的正確率，RMSEE，RMSECV和RMSEP的參數(shù)值均在0.25以下且RMSEP

表5 PLS-DA模型參數(shù)結(jié)果Table 5 The PLS-DA model results of Parameters

Hottelling T2檢測法為美國統(tǒng)計學(xué)大師哈羅德·霍特林所發(fā)明，是一種常見的多變量檢驗法[12]。 為檢驗本數(shù)據(jù)融合模型的準確性，采用多元統(tǒng)計分析Hottelling T2檢測法對初級融合與中級融合進行異常值檢驗。 圖2(a)和(c)為初級融合和中級融合的Hottelling T2異常值檢驗結(jié)果，其中T2Crit(99.00%)為38.820 8和33.667，T2Crit(95.00%)為30.371 1和26.060 8。 超出T2Crit(99.00%)置信區(qū)間的樣品則為異常樣品，圖中所有樣品的初級融合與中級融合都沒有超過T2Crit(99.00%)置信區(qū)間，表明在模型不存在異常值，具有準確性與可信性。 圖2(b)和(d)為初級融合與中級融合得分圖，初級融合得分圖中13個產(chǎn)地美味牛肝菌相同產(chǎn)地可大致聚在一起，中級融合得分圖的產(chǎn)地分類效果明顯高于初級融合，訓(xùn)練集和預(yù)測集均達到100.00%。

圖2 初級融合和中級融合的Hottelling T2置信圖與得分圖(a)： 初級融合Hottelling T2置信圖； (b)： 初級融合得分圖； (c)： 中級融合Hottelling T2置信圖； (d)： 中級融合得分圖Fig.2 Hotelling T2 confidence map and score map for primary and intermediate fusion(a): Hotelling T2 confidence map with primary fusion; (b): Primary fusion score map; (c): Intermediate fusion hottelling T2 confidence map; (d) Intermediate fusion score map

2.6 SVM

SVM是數(shù)據(jù)中以分類或回歸分析的監(jiān)督式學(xué)習(xí)模型算法，在世界上被廣泛應(yīng)用[13]。 對數(shù)據(jù)先進行Kennard-Stone分類，分為2/3預(yù)測集和1/3訓(xùn)練集，再采用SVM網(wǎng)格搜索最佳的c和g并對四種單一數(shù)據(jù)以及初級融合與中級融合數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明： 數(shù)據(jù)錯分類數(shù)從低到高排列中，中級融合=FTIR-MIR>初級融合>元素>FTIR-NIR>UV-Vis； 錯分類數(shù)依次為0，0，2，5，6和7。 中級融合和FTIR-MIR全部分類正確，效果優(yōu)于初級融合、元素、FTIR-NIR和UV-Vis。 說明在美味牛肝菌產(chǎn)地鑒別中，光譜種類的選擇和數(shù)據(jù)融合方法對鑒別效果具有重要意義。 表6列出了四種單一模型與兩種數(shù)據(jù)融合模型的懲罰系數(shù)、核函數(shù)半徑、內(nèi)部交叉驗證正確率和種類預(yù)測正確率。 其中FTIR-NIR，UV-Vis和元素的內(nèi)部交叉驗證正確率和種類預(yù)測正確率較低，正確率均在90.00%以下。 表明大多數(shù)單一數(shù)據(jù)的SVM模型效果不佳； 但FTIR-MIR模型與中級融合模型的內(nèi)部交叉驗證正確率和種類預(yù)測正確率都可達到97.65%與100.00%。 在數(shù)據(jù)融合中，中級融合效果高于初級融合，表明經(jīng)過篩選后的數(shù)據(jù)避免了大部分無效信息干擾，提高了分類模型正確率。 通過表5和表6可知，在PLS-DA分類模型和SVM分類模型中，數(shù)據(jù)融合建立的分類模型效果顯著優(yōu)于單一數(shù)據(jù)模型。 PLS-DA分類模型效果優(yōu)于SVM分類模型。 PLS-DA分類模型可以作為美味牛肝菌產(chǎn)地鑒別的最佳方法。

表6 SVM模型預(yù)測結(jié)果Table 6 The results of SVM models

3 結(jié) 論

采集美味牛肝菌樣品的FTIR-MIR，F(xiàn)TIR-NIR和UV-Vis光譜信息和不同部位礦質(zhì)元素，對光譜信息進行預(yù)處理，使用Kennard-Stone算法把數(shù)據(jù)分為2/3的訓(xùn)練集合1/3的預(yù)測集后對單一數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)融合進行PLS-DA模型和SVM模型。 結(jié)果表明，美味牛肝菌不同部位和不同產(chǎn)地之間元素含量具有差異。 原始光譜圖中不同產(chǎn)地美味牛肝菌的光譜特征具有差異，可進行產(chǎn)地區(qū)分。 對優(yōu)化后的數(shù)據(jù)建立PLS-DA和SVM，經(jīng)過數(shù)據(jù)融合后的建模效果比單一數(shù)據(jù)建模更好。 中級融合PLS-DA模型的訓(xùn)練集和預(yù)測集達到了100.00%，可區(qū)分不同產(chǎn)地的美味牛肝菌。 多光譜數(shù)據(jù)結(jié)合不同部位礦質(zhì)元素建立PLS-DA模型可用于野生食用菌產(chǎn)地溯源研究。