劉曉東，溫雯靜，趙志軍

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南漯河 462002)

肝臟是人體重要的代謝器官，肝損傷會(huì)對(duì)人的生活質(zhì)量產(chǎn)生較大的影響。目前，伴隨人們生活方式的改變以及環(huán)境的變化，肝病呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。其中化學(xué)性肝損傷是比較常見的發(fā)病原因，嚴(yán)重時(shí)易導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)生[1]。四氯化碳(CCl4)是常用的誘導(dǎo)肝損傷的化學(xué)溶劑，容易導(dǎo)致肝細(xì)胞分泌大量的炎癥因子，加大炎癥反應(yīng)，同時(shí)還可通過促進(jìn)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，誘發(fā)肝損傷的發(fā)生[2]。

多穗柯(lithocarpus polystachyus Rehd.) 為常見的民間草藥，具有清熱利尿、滋潤(rùn)肝腎等功效。研究顯示，多穗柯含有豐富的黃酮類化合物，含量達(dá)到10%，具有抗炎、抗氧化、降血脂等功能，但對(duì)于肝損傷的影響鮮有報(bào)道[3]。本研究采用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷建立動(dòng)物模型，觀察多穗柯總黃酮(total flavonoids extracts ofLithocarpuspolystachyusRehd，TFL)對(duì)其保護(hù)作用，并分析其保肝作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 健康清潔級(jí)昆明小鼠60只，雄性，體質(zhì)量(22±2) g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(豫)2015-0005，使用許可證號(hào)：SYXK(豫)2016-0002。飼養(yǎng)溫度為(24±2) ℃，12 h光照/12 h黑暗的室內(nèi)，常規(guī)飼料，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 多穗柯采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)，經(jīng)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校趙喜蘭副教授鑒定為殼斗科櫟屬常綠植物。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確秤取干燥的多穗柯葉5 kg，選擇70%乙醇按照1：20 的料液浸泡12 h，70 ℃、540 W 條件下，采用超聲波提取儀提取 3 次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得濃縮液。濃縮液上AB-8大孔樹脂，選擇75%乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空冷凍干燥得 TFL粉末。亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)得總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.2%。

1.3試劑 水飛薊素，純度≥98%(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：M1120A)；CCl4(廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：171103)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20170812，20170927，20170823，20170818，20170924，20170815，20170813，20171108)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：P0012S)；一抗含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)(批號(hào)：ab232401)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)(批號(hào)：ab47092)、caspase-1(批號(hào)：ab179515)、GAPDH(批號(hào)：ab181602)及二抗IgG(羊抗兔，批號(hào)：ab150077)，均為美國(guó)Abcam公司。

1.4儀器 AL104 型電子天平(瑞士梅特勒托利多儀器公司，感量：0.1 mg)；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV-2501PC 型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.5方法

1.5.1分組及造模 60只昆明小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分成6組，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、水飛薊素組(水飛薊素120 mg·kg-1)、TFL小、中、大劑量組(50，100，150 mg·kg-1)。小鼠飼養(yǎng)一周后開始試驗(yàn)，灌胃體積為15 mL·kg-1，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃等劑量的0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥2 h后，模型對(duì)照組及各給藥組小鼠按劑量5 mL·kg-1腹腔注射6% CCl4橄欖油溶液，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射同體積橄欖油，禁食不禁水。

1.5.2相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 造模6 h，摘眼球取血，半徑為13.5 cm，3000 r·min-1離心 10 min，分離血清，測(cè)定血清ALT、AST水平。小鼠處死，取肝臟，4 ℃0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干稱重，并計(jì)算肝指數(shù)(肝指數(shù)/%=肝質(zhì)量×100/體質(zhì)量)。秤取肝左葉100 mg，加入0.9%氯化鈉溶液冰浴勻漿，半徑為13.5 cm，4 ℃，3500 r·min-1離心10 min，取上清液，測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、GSH-Px、MDA水平。

1.5.3肝組織學(xué)觀察 取肝右葉用10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，并進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)觀察。

1.5.4蛋白水平的測(cè)定 采用Western blotting法，常規(guī)方法提蛋白質(zhì)，調(diào)整各樣本蛋白總量，參照說明書行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，孵育二抗，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，以GAPDH為內(nèi)參分析待測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)值。

2 結(jié)果

2.1多穗柯總黃酮對(duì)體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠的肝質(zhì)量、肝指數(shù)均明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，水飛薊素組、TFL中、大劑量組肝質(zhì)量、肝指數(shù)均明顯降低(P<0.01)，而對(duì)小鼠體質(zhì)量無明顯影響。見表1。

2.2多穗柯總黃酮對(duì)ALT、AST的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠ALT、AST活力均明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，水飛薊素組、TFL中、大劑量組ALT、AST活力均明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.3多穗柯總黃酮對(duì)肝組織 IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠的肝組織 IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，水飛薊素組、TFL中、高劑量組肝組織 IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P<0.01)。見表3。

表1 多穗柯總黃酮對(duì)體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響

表2 多穗柯總黃酮對(duì)ALT、AST的影響

Tab.2 Effect of TFL on ALT and AST

表2 多穗柯總黃酮對(duì)ALT、AST的影響

組別ALTAST正常對(duì)照組67.13±11.3884.32±10.29模型對(duì)照組203.48±21.28①170.12±15.48①水飛薊素組149.25±16.03②98.26±13.46②TFL 小劑量組196.37±20.27160.26±14.27 中劑量組151.27±17.16②119.42±12.47② 大劑量組141.46±15.72②101.27±10.36②

①與正常對(duì)照組比較，t=14.616～17.868，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=6.46～11.689，P<0.01。

①compared with normal control group，t=14.616-17.868，P<0.01；②compared with model control group，t=6.46-11.689，P<0.01.

2.4多穗柯總黃酮對(duì)肝組織SOD、GSH、MDA水平的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠的肝組織SOD、GSH水平均明顯降低，MDA明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，水飛薊素組、TFL中、大劑量組肝組織SOD、GSH水平均明顯升高，MDA明顯降低(P<0.05)。見表4。

2.5肝組織學(xué)觀察 模型對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變，部分肝細(xì)胞壞死。水飛薊素組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，空泡樣變和肝細(xì)胞壞死明顯減少；與模型對(duì)照組比較，不同劑量多穗柯總黃酮均能有效改善肝組織損傷，空泡樣變和肝細(xì)胞壞死明顯減少。見圖1。

表3 多穗柯總黃酮對(duì)肝組織 IL-1β以及血清IL-6、TNF-α水平的影響

Tab.3 Effect of TFL on the IL-1β level in liver tissue and the serum levels of IL-6 and TNF-α

表3 多穗柯總黃酮對(duì)肝組織 IL-1β以及血清IL-6、TNF-α水平的影響

組別IL-1βIL-6TNF-α正常對(duì)照組8.82±0.588.24±0.380.66±0.13模型對(duì)照組19.28±1.26①17.01±1.67①1.48±0.58①水飛薊素組11.12±0.26②10.02±0.42②0.79±0.12②TFL 小劑量組17.38±1.3613.28±1.581.27±0.46 中劑量組14.18±0.98②10.48±1.36②0.81±0.19② 大劑量組11.26±0.86②9.06±1.21②0.69±0.37②

①與正常對(duì)照組比較，t=4.362～16.192，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=3.471～20.057，P<0.01。

①compared with normal control group，t=4.362-16.192，P<0.01；②compared with model control group，t=3.471-20.057，P<0.01.

表4 多穗柯總黃酮對(duì)肝組織SOD、GSH、MDA水平的影響

組別SOD/(U·mg-1)GSH/(mg·g-1)MDA/(nmoL·mg-1)正常對(duì)照組104.27±4.787.26±1.591.55±0.45模型對(duì)照組38.57±2.48①3.05±0.78①4.35±0.53①水飛薊素組88.39±4.15②5.59±0.66②2.38±0.48②TFL 小劑量組53.46±3.58②3.75±0.72②3.68±0.49② 中劑量組75.28±2.47②5.08±0.76②3.12±0.53② 大劑量組82.47±2.67②5.72±0.42②2.42±0.47②

2.6蛋白水平的測(cè)定 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠的肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1水平均明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，水飛薊素組、TFL小、中、大劑量組的肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1明顯降低(P<0.01)。見圖2，表5。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.水飛薊素組；D.TFL小劑量組；E.TFL中劑量組；F.TFL大劑量組。

1.正常對(duì)照組；2.模型對(duì)照組；3.水飛薊素組；4.TFL小劑量組；5.TFL中劑量組；6.TFL大劑量組。

3 討論

肝損傷主要涉及肝病進(jìn)展，包括炎癥、纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌。正常的肝細(xì)胞是容易受到食源性毒素、嗜肝病毒的感染和細(xì)菌感染。研究顯示，CCl4可通過氧化脅迫和脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的急性肝損傷[4]。CCl4

表5 多穗柯總黃酮對(duì)肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1水平的影響

代謝時(shí)，可生成大量自由基，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化以及級(jí)聯(lián)反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)改變細(xì)胞膜的通透性，從而觸發(fā)肝毒性，并出現(xiàn)肝組織損傷，釋放部分活性物質(zhì)進(jìn)入血液中[5]。本研究中，模型對(duì)照組小鼠血清中AST、ALT水平明顯高于對(duì)照組，結(jié)合病理切片觀察，顯示模型對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變，部分肝細(xì)胞壞死，說明急性肝損傷的動(dòng)物模型建立成功。本研究中，TFL給藥組ALT，AST水平較模型對(duì)照組明顯降低，結(jié)合病理切片觀察，顯示不同劑量的TFL均能有效改善肝組織損傷，并具有一定的劑量效應(yīng)，說明TFL對(duì)急性肝損傷大鼠具有一定程度的保護(hù)作用。

GSH是一種重要的抗氧化劑，可以清除ROS所致肝毒性。SOD負(fù)責(zé)將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫。 MDA是脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物。當(dāng)CCl4誘發(fā)較高水平自由基時(shí)，GSH、SOD將被大量消耗，此時(shí)膜結(jié)構(gòu)損傷明顯加重，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平顯著增加[6]。因此SOD、GSH和MDA水平能反映CCl4誘發(fā)的氧化應(yīng)激所致肝損傷的程度。在這項(xiàng)研究中，TFL給藥可顯著增加肝臟抗氧化能力，如其特征在于TFL可以減少CCl4所致氧化應(yīng)激中MDA水平，升高抗氧化劑SOD、GSH水平，抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，維持膜的正常結(jié)構(gòu)，從而避免肝細(xì)胞的損傷，同時(shí)也提示TFL可通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮對(duì)肝損傷的保護(hù)作用。

越來越多的證據(jù)表明，壞死、炎癥反應(yīng)在CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性中起重要作用[7]。其中TNF-α在肝損傷發(fā)生過程中扮演著重要的角色，可誘發(fā)肝星形細(xì)胞分泌、釋放多種炎性遞質(zhì)。同時(shí)還會(huì)活化中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致超氧陰離子和蛋白酶水平明顯增加，從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生。而IL-1β主要可以導(dǎo)致組織局部炎癥反應(yīng)，并作用于單核巨噬細(xì)胞，誘發(fā)IL-6 的合成和分泌，而IL-6的異常升高會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生免疫病理反應(yīng)[8]。因此，TNF-α、IL-1β和IL-6能反映肝損傷的程度[8]。本研究中，TFL對(duì)CCl4所致急性肝損傷通過下調(diào)炎癥誘導(dǎo)肝臟炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6發(fā)揮保護(hù)作用。

NLRP3 炎性復(fù)合體屬于NLR家族成員，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，易被活性氧(ROS)等因素活化。而CCl4誘發(fā)的氧化應(yīng)激所致的膜脂過氧化損傷常導(dǎo)致較高水平的ROS的發(fā)生[9]。因此。肝損傷發(fā)生時(shí)，高水平的ROS的釋放是激活 NLRP3 的重要途徑，是NLRP3激活的近端信號(hào)。當(dāng)NLRP3 受到內(nèi)外源性因素影響時(shí)，其將發(fā)生低聚化，并募集 pro-caspase-1 和ASC 共同組建形成 NLRP3 炎性小體，并調(diào)節(jié)、活化pro-caspase-1 轉(zhuǎn)變成有活性的Caspase-1，在此基礎(chǔ)上，通過剪切IL-1β前體，激活其成熟和分泌，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。因此，調(diào)控NLRP3 炎性小體也是對(duì)肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用的重要機(jī)制。本研究中，TFL能顯著降低NLRP3、ASC、Caspase-1水平，表明TFL抑制 NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是其發(fā)揮對(duì)急性肝損傷保護(hù)作用的重要機(jī)制。

總之，TFL對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，與減輕氧化應(yīng)激水平，改善炎癥因子的產(chǎn)生，調(diào)控ROS/NLRP3/IL-1β信號(hào)通路有關(guān)。通過闡明TFL保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷機(jī)制，可以為臨床急性肝損傷的治療提供參考，同時(shí)也為多穗柯的開發(fā)提供依據(jù)。