唐蕾，艾超

(清華大學(xué)附屬北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院藥學(xué)部，清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，北京 102218)

長(zhǎng)春西汀(vinpocetine)是從夾竹桃科小蔓長(zhǎng)春花中提取出的一種吲哚類(lèi)生物堿，化學(xué)名為乙基阿樸長(zhǎng)春胺-22-乙酸乙酯，系腦血管擴(kuò)張劑，能維持或恢復(fù)腦血管的生理性擴(kuò)張，增加缺血區(qū)的正常腦血流量，改善缺氧腦組織的代謝[1-2]。長(zhǎng)春西汀脂溶性較強(qiáng)，進(jìn)入體內(nèi)之后可以迅速轉(zhuǎn)化成其活性代謝物阿樸長(zhǎng)春胺酸[3-4]而發(fā)揮藥效，臨床應(yīng)用廣泛而重要。

目前有薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)、質(zhì)譜法(mass spectrum,MS)、放射色譜法、紅外光譜法(infrared absorption spectrum,IR)測(cè)定生物樣品中長(zhǎng)春西汀或阿撲長(zhǎng)春胺酸單一成分。但所采用的放射色譜法、紅外光譜法等分析方法靈敏度低、樣品制備繁瑣并且對(duì)人體輻射危害較大。因此筆者在本實(shí)驗(yàn)擬采用快速、靈敏、專屬的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)對(duì)長(zhǎng)春西汀在大鼠體內(nèi)的代謝進(jìn)行研究，推測(cè)其在體內(nèi)可能的代謝途徑，為長(zhǎng)春西汀的體內(nèi)代謝研究提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1儀器 Waters Quattro Micro API型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子化源(ESI源)及Masslynx 4.1 系統(tǒng)軟件，美國(guó)Waters公司；ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；L-128B型試管氮吹濃縮儀(北京來(lái)亨科貿(mào)有限公司)；L-119 型試管恒溫加熱儀(上海來(lái)亨科貿(mào)有限公司)；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭儀器廠)；AL-104型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，感量：0.1 mg]。

1.2試藥 長(zhǎng)春西汀對(duì)照品(含量：99.4%，批號(hào)：100947-201203，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；阿樸長(zhǎng)春胺酸對(duì)照品(含量：99.8%，批號(hào)：1166-002A3，加拿大TLCPharmaChem Inc公司)；長(zhǎng)春西汀片劑(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，規(guī)格：每片5 mg)；甲醇為色譜純，購(gòu)自TEDIA，純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.3動(dòng)物 健康雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量230～240 g，沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001號(hào)。飼養(yǎng)條件：溫度(22±2) ℃，相對(duì)濕度(50±10)%，12 h交替照明，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.4樣品的收集與處理

1.4.1給藥方案與樣品的收集 給藥方案：健康SD大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水。以相當(dāng)于長(zhǎng)春西汀4 mg·kg-1的劑量灌胃給藥，給藥后繼續(xù)禁食4 h(長(zhǎng)春西汀成人用法用量，30 mg·d-1。換算SD大鼠計(jì)量4 mg·kg-1)，大鼠尿液樣品的收集：每只大鼠單獨(dú)置于代謝籠內(nèi)飼養(yǎng)，12 h 晝夜更替。實(shí)驗(yàn)前收集空白尿液，灌胃給藥后，于冰浴條件下收集0～24 h尿液樣品，置-80 ℃冷凍保存，待測(cè)。

1.4.2樣品預(yù)處理 采用固相萃取的方法進(jìn)行預(yù)處理，用甲醇、水各3.0 mL 交替活化固相萃取小柱各兩次。取3500 r·min-1，離心半徑r=6.5 cm，離心10 min后的尿液樣品1 mL，微孔濾膜過(guò)濾，以1.5 mL·min-1速度通過(guò)上述已經(jīng)活化好的固相萃取柱，依次用水1 mL，甲醇(1 mL×2)洗脫，收集甲醇部分的洗脫液，于40 ℃氮?dú)庀麓蹈?，殘?jiān)眉状?水(10：90，V/V)混合溶液100 μL 溶解，20 μL進(jìn)樣分析。

1.5LC-MS/MS分析條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相為甲醇-水梯度洗脫：甲醇在15 min內(nèi)從10%線性變化至95%，維持3 min，之后恢復(fù)到初始條件，平衡3 min；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30 ℃。

1.5.2質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源(ESI源)；毛細(xì)管電壓為2.0 kV；錐孔電壓為40 V(長(zhǎng)春西汀、阿樸長(zhǎng)春胺酸)和20 V(內(nèi)標(biāo)非那西汀)；去溶劑氣為氮?dú)?N2)；去溶劑氣溫度為400 ℃；源溫度為110 ℃；去溶劑氣流速為450 L·h-1，采用正離子方式檢測(cè)；采用一級(jí)全掃描、選擇離子監(jiān)測(cè)和產(chǎn)物離子掃描方式同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1長(zhǎng)春西汀的質(zhì)譜裂解規(guī)律 見(jiàn)圖1，2。由圖1可知，長(zhǎng)春西汀原型M0(m/z351)含有酯鍵不穩(wěn)定，容易斷裂生成阿樸長(zhǎng)春胺酸(M1m/z323)；M0和M1易脫掉含氮的三元環(huán)、四元環(huán)和五元環(huán)生成m/z308、m/z280、m/z266的碎片離子。

圖1 M0的二級(jí)質(zhì)譜圖及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2大鼠尿液中的代謝研究 大鼠空白尿液樣品和灌胃給予長(zhǎng)春西汀后尿液樣品的SIR色譜圖見(jiàn)圖3所示。同空白尿樣相比，給藥后的大鼠尿樣中共檢測(cè)到4種代謝物。通過(guò)與對(duì)照品的色譜、質(zhì)譜行為比較，鑒定了1個(gè)代謝物的結(jié)構(gòu)，為阿樸長(zhǎng)春胺酸(M1)。通過(guò)綜合分析色譜保留行為、準(zhǔn)分子離子和二級(jí)碎片離子，并根據(jù)藥物代謝規(guī)律，推斷了3個(gè)代謝物的結(jié)構(gòu) (M2a/M2b、M3、M4)。

代謝物M1。色譜保留時(shí)間為5.6 min。準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z323，通過(guò)與阿樸長(zhǎng)春胺酸的對(duì)照品比對(duì)，鑒定出M1為阿樸長(zhǎng)春胺酸，M1的質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律見(jiàn)圖4，5。

圖2 推測(cè)的M0質(zhì)譜裂解規(guī)律

圖3 大鼠尿液中長(zhǎng)春西汀代謝物的典型SIR色譜圖A.空白尿液；B.含藥尿液

圖4 M1的色譜圖及其準(zhǔn)分子離子峰的二級(jí)質(zhì)譜圖A.對(duì)照品；B.含藥尿液樣品；C.二級(jí)質(zhì)譜圖

圖5 推測(cè)的M1質(zhì)譜裂解規(guī)律

代謝物M2。色譜保留時(shí)間為12.4和13.3 min，準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z367，比原型藥物多16 Da，提示可能為長(zhǎng)春西汀的一羥基化代謝物。在LC-MS/MS分析中，產(chǎn)生碎片離子m/z323、m/z294和m/z280。其中，m/z323為與原型一致的酯鍵水解生成的碎片離子，m/z294和m/z280推測(cè)為分別脫掉含氮的四元環(huán)和含氮的五元環(huán)生成的碎片離子(圖6)。由文獻(xiàn)[5]可知羥化位點(diǎn)存在于苯環(huán)上，但具體的羥化位點(diǎn)不確定，推測(cè)M2a和M2b為苯環(huán)上羥化部位不同的兩個(gè)同分異構(gòu)體。M2的質(zhì)譜裂解規(guī)律見(jiàn)圖7。

圖6 M2的二級(jí)質(zhì)譜圖及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖7 推測(cè)的M2質(zhì)譜裂解規(guī)律

代謝物M3。色譜保留時(shí)間為10.6 min，準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z369，比原型藥物的準(zhǔn)分子離子多18 Da，提示其可能為長(zhǎng)春西汀一水加成物。在LC-MS/MS分析中，產(chǎn)生的碎片離子m/z351推測(cè)為脫掉水生成的碎片，并且m/z351進(jìn)一步生成的碎片離子m/z323、m/z294、m/z280和m/z308與M0的碎片一致，根據(jù)文獻(xiàn)[5]推測(cè)M3為M0的一水加成物。見(jiàn)圖8。

代謝物M4。色譜保留時(shí)間為11.5 min，準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z383，與原型藥相比多32 Da，提示其可能為長(zhǎng)春西汀二羥基化代謝物。在LC-MS/MS分析中，產(chǎn)生碎片離子m/z367、m/z337和m/z305，其中m/z367的碎片離子比m/z383的碎片離子少16 Da，提示為后者脫掉一個(gè)羥基上的氧生成的碎片離子，m/z337的碎片離子推測(cè)為在m/z367的基礎(chǔ)上脫掉側(cè)鏈上的乙基再生成雙鍵產(chǎn)生的碎片離子，m/z305的碎片離子比m/z337的碎片離子少32 Da，提示由后者進(jìn)一步脫掉2個(gè)氧生成的碎片離子。見(jiàn)圖9。因此，推測(cè)代謝物M4為長(zhǎng)春西汀的二羥基化代謝物，但是具體的羥化位點(diǎn)不確定。M4的質(zhì)譜裂解規(guī)律見(jiàn)圖10。

圖8 M3的二級(jí)質(zhì)譜圖及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖9 M4的二級(jí)質(zhì)譜圖及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖10 推測(cè)的M4質(zhì)譜裂解規(guī)律

2.3長(zhǎng)春西汀在大鼠尿液中代謝的總結(jié) 根據(jù)檢測(cè)到的上述代謝物，可以推斷長(zhǎng)春西汀在大鼠尿液中有4種代謝途徑，分別為酯鍵水解，一水加成，一羥基化和二羥基化，均屬于Ⅰ相代謝。

3 討論

關(guān)于長(zhǎng)春西汀的體內(nèi)代謝研究，VERECZKEY[5]采用薄層色譜法(TLC)和質(zhì)譜法(MS)結(jié)合的方法研究了長(zhǎng)春西汀在比格犬體內(nèi)的代謝，共檢測(cè)出3種代謝物：阿樸長(zhǎng)春胺酸、一羥基化長(zhǎng)春西汀和二羥基化阿樸長(zhǎng)春胺酸甘氨酸結(jié)合物；VERECZKEY等[6]采用放射色譜法、MS和紅外光譜法(IR)結(jié)合的方法研究了長(zhǎng)春西汀在大鼠體內(nèi)的代謝，檢測(cè)到的代謝物與文獻(xiàn)[5]一致。YANG等[7]總結(jié)了長(zhǎng)春西汀及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物在大鼠、兔、犬及人體內(nèi)的代謝物，除了以上3種外，還有一羥基化阿樸長(zhǎng)春胺酸、長(zhǎng)春西汀一水合物、二羥基化阿樸長(zhǎng)春胺酸甘氨酸結(jié)合物及與葡萄糖醛酸或硫酸的結(jié)合物。本實(shí)驗(yàn)對(duì)長(zhǎng)春西汀在大鼠體內(nèi)的代謝情況進(jìn)行了初步研究，對(duì)大鼠尿液中長(zhǎng)春西汀代謝物的結(jié)果分析，通過(guò)與代謝物對(duì)照品的色譜、質(zhì)譜行為比較，鑒定了1個(gè)代謝物的結(jié)構(gòu)(M1)，通過(guò)綜合分析色譜保留行為、準(zhǔn)分子離子和二級(jí)碎片離子，推斷了3個(gè)代謝物的結(jié)構(gòu) (M2、M3、M4)，分別是M1-阿樸長(zhǎng)春胺酸、M2-長(zhǎng)春西汀一羥基化合物、M3-長(zhǎng)春西汀一水加成物和M4-長(zhǎng)春西汀二羥基化合物，M4筆者目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為長(zhǎng)春西汀的體內(nèi)代謝研究提供借鑒和參考。