金如昌，杜鄧襄，李旭欣，楊 涵，劉江江，郭金潔，張 丹，張方東

(華中農(nóng)業(yè)大學 植物科學技術學院， 武漢 430070)

玉米是中國第一大作物，不僅可以作為糧食直接食用，又可作為飼料、工業(yè)原料等，對國民經(jīng)濟發(fā)展具有重要的作用。隨著人口快速的增長，可耕地面積的不斷減少，全球氣候變暖等問題，使得糧食生產(chǎn)遭受巨大的挑戰(zhàn)，提高玉米單位面積產(chǎn)量顯得更加重要。玉米產(chǎn)量是一個較為復雜的農(nóng)藝性狀，受多種基因與環(huán)境作用所控制。其中，光合作用、氮素同化、碳源分配、植株株型等生理過程是產(chǎn)量形成的基礎[1]。近幾十年來，隨著一些控制產(chǎn)量形成過程中相關基因逐漸被發(fā)現(xiàn)，基因工程技術在提高玉米產(chǎn)量方面取得巨大進展[2]。Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在玉米中過表達shrunken-2基因和brittle-2基因，增加15%玉米種子產(chǎn)量。Xie等[4]發(fā)現(xiàn)過表達Zmdar1、Zmda1基因玉米純合株系中穗粒數(shù)增加，粒質量顯著增加，小區(qū)產(chǎn)量提高15%～22%。最近，Wang等[5]在玉米中過表達ZmNF-YB16基因，其中過表達株系在正常條件下百粒質量提高10%～16%，在干旱脅迫處理后百粒質量提高61%～69%。以上說明通過增強產(chǎn)量形成相關基因的表達，可以獲得使產(chǎn)量性狀明顯改善的轉基因玉米。

玉米籽粒胚乳約占玉米體積和干質量的80%，胚乳發(fā)育過程中庫容的建成與庫容的充實程度一定程度上決定了玉米的粒質量[6]。谷物種子的發(fā)育依靠從母體組織中吸收營養(yǎng)物質來生長，但是由于母體和種子間不存在共生關系，韌皮部中的營養(yǎng)物質需要從籽粒的母體一側卸下進入質外體，并由專門負責溶質運輸?shù)呐呷榧毎M入體內，這些細胞位于籽?；浚纬膳呷榛總鬟f細胞層(Basal Endosperm Transfer Layer，BETL)[7-9]。授粉后6～10d，位于胚乳基部的細胞轉化為傳遞細胞，傳遞細胞形成一個廣泛的細胞壁生長網(wǎng)絡，外層胚乳傳遞細胞向內形成了明顯的溶質梯度，從而有利于營養(yǎng)物質向胚乳內部的運輸[10-11]。目前在玉米BETL細胞表達的許多基因，已經(jīng)被鑒定出來[12-15]。其中ZmMRP-1(ZeamaysMYB-related-Protein1)，是第一個鑒定出來的具有反式特異激活傳遞細胞表達的轉錄因子。ZmMRP-1編碼一個MYB結構域轉錄因子，該轉錄因子屬于R1MYB蛋白SHAQKYF家族[15]。ZmMRP-1的轉錄起始于胚乳發(fā)育的早期階段，在授粉3d后首先檢測到ZmMRP-1表達，并且在傳遞細胞發(fā)育的過程中持續(xù)存在。ZmMRP-1可與MEG1、ZmTCRR-1、ZmBETL-1、ZmBETL-2等傳遞細胞發(fā)育相關基因結合[16-18]，調控胚乳傳遞細胞發(fā)育相關基因的表達，從而在玉米傳遞細胞發(fā)育中發(fā)揮中重要作用。最近Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)，在開放授粉的Krug黃馬齒(Krug Yellow Dent)群體中選育出來的大粒(Krug Large Seed，KLS)和小粒(Krug Small Seed，KSS)自交系群體，比較大種子和小種子群體的轉錄水平時，KLS出現(xiàn)較高的ZmMRP-1表達水平，且表現(xiàn)為籽粒灌漿速率增加，提示ZmMRP-1在這一過程中可能通過對傳遞細胞層的分化和功能具有重要作用。

本試驗構建攜帶有玉米ZmMRP-1基因過表達載體pHZM1N-PZmMRP-1::ZmMRP-1，利用農(nóng)桿菌侵染愈傷組織的方法導入玉米自交系A188中，通過提高該基因在玉米中的表達，以期望獲得產(chǎn)量性狀改良的玉米新株系，為高產(chǎn)轉基因玉米新品種的選育提供材料支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米(ZeamaysL.)自交系A188、根癌農(nóng)桿菌(Agrobactriumtumefaciens)菌株EHA105、中間載體質粒pHZM1N-Rsc[20]，均由華中農(nóng)業(yè)大學玉米課題組保存。

1.2 載體的構建與鑒定

ZmMRP-1啟動子序列和ZmMRP-1orf序列均來源于Gómez 等[15]，ZmMRP-1的轉錄終止序列term來自玉米Rs基因的終止序列[21]，4XEnhancer序列來自Odell等[22]，以上序列設計好連接，合成在pUC57質粒的HindIII-EcoR1，然后亞克隆到pHZM1N-Rsc的pfi23II-XmaJ1位置，構成pHZM1N-PZmMRP-1::ZmMRP-1轉化載體，由南京金斯瑞公司完成。將構建好的載體質粒經(jīng)電擊法轉入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，挑取單菌落，提取質粒進行PCR檢測，由于ZmMRP-1是玉米內源基因，根據(jù)目的基因序列與啟動子序列設計特異性引物，擴增產(chǎn)物大小662 bp，引物序列ZmMRP-1F：5′-ATCAACCCGGCTAGTCCAAC-3′，ZmMRP-1R：5′-CATCA- GGTAGCCCTGCATCA-3′；標記基因egfp-iptII，擴增產(chǎn)物大小960 bp，egfp-iptIIF： 5′-CAAAGACCCAACGAGAAGC-3′，egfp-iptIIR：5′-AAAGCCCTCACCATCTCCATCTCCTC-3′。PCR反應體系(15 μL)：模板DNA 30 ng，Primer R(5 μmol/L)0.5 μL，Primer F(5 μmol/L)0.5 μL，2×Taqplus Master Mix 7.5 μL，ddH2O補至15 μL。PCR反應程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s， 57 ℃ 30 s，72℃ 1 min(30循環(huán))，72 ℃ 5 min。

1.3 農(nóng)桿菌侵染玉米愈傷組織轉化玉米 ZmMRP-1基因

1.3.1 農(nóng)桿菌菌液制備 將攜帶有pHZM1N-P::ZmMRP-1載體質粒的農(nóng)桿菌EHA105，在含有抗生素利福平(50 mg/L)和卡那霉素 (50 mg/L)的固體LB培養(yǎng)基上劃線，28 ℃倒置暗培養(yǎng)2 d，挑取單克隆于加有抗生素的液體LB培養(yǎng)基中28 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)，低速離心，收集菌液至50 mL的離心管中，加入含有 0.1 mmol/L的乙酰丁香酮(AS)侵染液，28 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)。測定OD600值，將OD值調至0.4～0.5。

1.3.2 農(nóng)桿菌介導轉化玉米愈傷組織 選取授粉10 d左右的A188幼胚誘導愈傷，挑選顏色鮮亮、質地松軟的玉米愈傷組織；將愈傷組織置入含農(nóng)桿菌的侵染液中浸泡30 min，共培養(yǎng)基中 19 ℃暗培養(yǎng)3 d。3 d后，用加特美汀的無菌水清洗愈傷組織5～6次直至水澄清為止；吹干愈傷組織后，轉入恢復培養(yǎng)基中。待愈傷組織恢復后，在熒光燈下挑取帶有綠色熒光愈傷組織，在42 ℃條件下熱激2 h，重復3次，以完全剔除標記基因[20]。將熱激處理過后的愈傷組織轉至分化培養(yǎng)基，時間為3～4周，之后將大小為2～3 cm左右的再生芽轉移到生根培養(yǎng)基中誘導生根，待苗長5～8 cm，根數(shù)達到 20 條左右時，揭蓋煉苗 2 d，挑選健壯的小苗轉入溫室種植[23]。

1.4 轉基因植株的PCR檢測

通過CTAB法小量提取植株幼嫩葉片總DNA，對目的基因ZmMRP-1進行PCR檢測，所用引物及體系見“1.2”，篩選陽性植株。

1.5 轉基因植株的Southern blot檢測

根據(jù)ZmMRP-1基因設計特異性探針，以質粒為模板擴增1 169 bp片段，回收目的片段，采用Roche試劑盒對探針進行地高辛標記(Cat.No.11585614910)。CTAB法提取高純度大量基因組DNA，DNA 30 μg，10×L buffer 4 μL，KpnI50U，補ddH2O至40 μL，37 ℃酶切 16 h。酶切產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠下，30 V電壓，電泳16 h。利用毛細管法將電泳后的酶切產(chǎn)物印跡到尼龍膜上；依據(jù)地高辛試劑盒說明書進行雜交及顯影過程。

1.6 轉 ZmMRP-1基因T2代植株轉錄水平的檢測

T2代陽性及野生型植株統(tǒng)一自交授粉后 3 d、6 d、12 d、15 d、21 d和30 d，用手術解剖刀分離胚乳，迅速放入液氮中保存。采用Trizol法，提取籽粒胚乳總RNA，用RNase-free DNaseⅠ(Thermo)消除基因組DNA；利用M-MLV反轉錄酶(Invitrogen)把RNA樣品反轉錄成cDNA。所用引物qZmMRP-1F：5′-CCGAACTTCAACAGCGTGTG-3′，qZmMRP-1R：5′-CAGGTAGCCCTGCATCAT-3′，以玉米Actin基因(GRMZM2G126010)為內參基因，根據(jù)SYBR Green qRT-PCR(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)試劑盒進行操作，qRT-PCR反應在Bio-Rad CFX96 Touch Realtime PCR detection system上進行。試驗設置3次生物學重復，以WT中的ZmMRP-1表達量設為1，所有表達倍數(shù)使用2-△△Ct計算。反應體系(20 μL)：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，Primer R (5 μmol/L)0.5 μL，Primer F(5 μmol/L) 0.5 μL ，ROX Reference Dye 0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.5 μL。qRT-PCR反應程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(30循環(huán))，72 ℃ 5 min。

1.7 轉基因材料產(chǎn)量性狀分析

以T2代轉基因陽性株系OE-8、OE-19，受體材料A188自交系為對照于2019年4月，播種在華中農(nóng)業(yè)大學玉米轉基因試驗田中，各株系及對照在重復內隨機排列，施肥及田間管理一致。待抽雄時，統(tǒng)計株高、穗位高。果穗成熟后，人工收獲，統(tǒng)計穗長，穗行數(shù)等性狀，曬干脫水至恒質量后，測定穗質量、穗粗、粒長、粒寬，稱量百粒質量等產(chǎn)量相關性狀。

1.8 統(tǒng)計分析方法

采用Excel 2018對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，使用SPSS(版本22.0.0)軟件進行單因素方差分析，Duncan’s多重比對完成。

2 結果與分析

2.1 過表達 ZmMRP-1基因載體構建及鑒定

本載體pHZM1N-PZmMRP-1::ZmMRP-1由pHZM1N-Rsc為骨架構建而來，載體中(圖1)使用融合基因egfp-iptII作為篩選標記基因，通過熱激處理，hsp70熱激啟動子驅動Cre重組酶基因表達，切除載體LoxP位點間的序列，從而獲得無篩選標記的轉基因植株。

對構建好的載體通過電擊法轉入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，提取質粒分別對目的基因ZmMRP-1，篩選標記基因egfp-iptII進行PCR檢測(圖2)，結果表明陽性對照(載體質粒)和農(nóng)桿菌中提取出來的質粒均擴增出來ZmMRP-1基因片段、篩選標記基因egfp-iptII片段，陰性對照(ddH2O)無條帶，并通過測序驗證和已知序列一致，表明成功將pH ZM1N-PZmMRP-1::ZmMRP-1表達載體導入到農(nóng)桿菌EHA105中 。

2.2 農(nóng)桿菌介導的玉米愈傷遺傳轉化和轉基因植株的PCR檢測

采用玉米愈傷組織轉基因方法，對ZmMRP-1基因進行玉米遺傳轉化，轉化流程如圖3，共獲得了121個農(nóng)藝性狀良好的的轉基因T0代植株，由于ZmMRP-1來源于玉米，結合對ZmMRP-1基因序列及啟動子序列分析，設計鑒定轉基因植株特異性引物，檢測上游引物在啟動子上，而下游引物在目的基因上。通過PCR反應鑒定，來源于12個獨立轉化事件的30個玉米植株擴增出633 bp與陽性對照相同的目的片段，陰性對照未轉基因植株自交系A188無條帶，部分檢測結果見圖4-A。初步說明ZmMRP-1基因已經(jīng)進入植物體內，陽性率為24.7%。對PCR檢測呈陽性幼苗，嚴格自交授粉，單穂收獲。

圖1 載體pHZM1N-P ZmMRP-1::ZmMRP-1 T-DNA區(qū)Fig.1 Schematic of T-DNA region of pHZM1N-P ZmMRP-1::ZmMRP-1 vector

2.3 轉基因植株的整合情況與表達量檢測

對部分陽性T1代株系，提取基因組DNA進行酶切，使用ZmMRP-1基因標記特異性探針進行Southern blot檢測(圖4-B)，結果表明OE-8、OE-10、OE-19只有一條雜交信號，且陰性對照非轉基因受體植株無條帶，說明ZmMRP-1基因已經(jīng)整合到玉米基因組上，并且以單拷貝的形式存在。為了更加細致的了解ZmMRP-1在轉基因玉米中的表達情況，我們利用qRT-PCR對T2代OE-8、OE-19單拷貝株系籽粒胚乳在自交授粉后3 d、6d、12 d、15 d、21 d和30 d進行表達量檢測。以同時期野生型材料為對照，發(fā)現(xiàn)轉基因植株胚乳中ZmMRP-1基因從授粉后3 d開始顯著上調，授粉后12 d表達強度達到最高，之后表達量降低，授粉后30 d基本不表達(圖4-C)。

A. ZmMRP-1基因的PCR檢測；B.egfp-iptII基因的PCR檢測；M.DL 2000 marker，分子量標準；1.質粒PCR;N.陰性對照;P.陽性對照

2.4 轉基因植株的產(chǎn)量性狀分析

2019年對轉ZmMRP-1基因T2代株系OE-8、OE-19以及受體自交系A188進行產(chǎn)量相關性狀考察，由圖5和表 1可知轉基因植株在粒長、粒寬、百粒質量、穗粗、穗質量方面都極顯著增加，株高、穗位高、穂長、穂行數(shù)、穂粒數(shù)方面并未出現(xiàn)明顯差異。測量籽粒大小，發(fā)現(xiàn)粒長由0.85 cm增至0.90～0.93 cm，增加5.88%～9.41%；粒寬由0.73 cm增至0.77～0.80 cm，增加5.48%～ 9.59%；百粒質量由17.26 g增至 18.67～19.02 g，增加了8.17%～10.20%。結果表明，在玉米中過表達ZmMRP-1基因，通過提高玉米籽粒粒寬、粒長、百粒質量的方式以達到改善玉米產(chǎn)量相關性狀目的。

A.轉 ZmMRP-1基因植株的PCR檢測，M.DL2000 marker，1-4.轉基因植株，N.陰性對照，P.陽性對照；B.轉 ZmMRP-1基因的Southern blot檢測，M.DNAmarker，P.陽性質粒對照，WT.非轉基因植株基因組DNA，OE-18、OE-10、OE-19轉基因植株基因組DNA，經(jīng)KpnI單酶切后，使用基因特異性探針進行雜交；C.轉 ZmMRP-1基因材料授粉后不同時間表達量，圖中所示數(shù)據(jù)為3次生物學重復的平均值±標準差

WT.未轉基因A188自交系，OE-8、OE-19為過表達 ZmMRP-1玉米株系，Bar=2 cm

3 討論與結論

玉米的產(chǎn)量主要受到源、庫、流的影響，三者之間既相互促進，又相互制約[24]，根據(jù)玉米高產(chǎn)理論指導，從這三個主要途徑采取常規(guī)措施，提高玉米的產(chǎn)量的科學研究都有報道[25-27]。通過基因工程手段，在玉米中過量表達與源、庫、流的相關基因，也可以為創(chuàng)制高產(chǎn)玉米新材料提供幫助。如在玉米中過量表達谷氨酰胺合成酶Gln1-3基因，轉基因植株功能葉氮含量和光合效率明顯高于對照，進而增加產(chǎn)量[28]；在玉米中過表達細胞壁轉化酶基因，顯著增強了光合產(chǎn)物運輸中卸載能力，增加玉米粒質量和粒數(shù)并提高淀粉含量[2]；轉海藻糖-6-磷酸酯酶基因，降低了糖合成代謝的抑制信號，解除了籽粒中的糖合成代謝的限制因素，進而提高玉米正常和干旱條件下的產(chǎn)量[29]；增強KNR6基因的表達，能夠促進玉米果穗的發(fā)育，增加了玉米穂長和行粒數(shù)，來提高玉米庫容量[30]?！傲鳌弊鳛槿齻€要素的中間環(huán)節(jié)，連接源和庫。葉片運出同化物到貯存或活躍生長的“庫”的運輸是由若干個生理過程和結構所控制的，是一個高度完整的體系，包括韌皮部的裝載、篩管中運輸、韌皮部卸出和同化物的重新吸收[24]。在維管束組織與胚乳之間的營養(yǎng)物質傳遞中，玉米胚乳基部傳遞細胞層處于“流”中的關鍵環(huán)節(jié)，對胚乳吸收營養(yǎng)成分具有起著重要的作用。另外，ZmMRP-1是調節(jié)下游許多基因表達的轉錄因子，但是關于ZmMRP-1基因自身的調控目前的研究不多。玉米ZmMRP-1的啟動子轉錄活性，受到細胞壁轉化酶的活性調節(jié)，也即受到蔗糖濃度的調節(jié)[31]。在這里ZmMRP-1基因的調控通路與蔗糖在轉移細胞層的卸載轉運等發(fā)生了密切的聯(lián)系，但具體的機制還不清楚。而本試驗中，轉化基因ZmMRP-1是用的自身啟動子，同樣會受到上游轉化酶活性和蔗糖的調節(jié)。同時，增強表達的ZmMRP-1基因又會調節(jié)下游的基因加強轉錄。目前對本實驗中得到的轉基因材料還暫時沒有開展上游和下游方面的研究。如果能進一步的深入探索闡明相關調控網(wǎng)絡系統(tǒng)的具體細節(jié)，再通過遺傳操作技術，解除抑制環(huán)節(jié)，增強促進環(huán)節(jié)，應該有更好的效果。

表1 轉 ZmMRP-1基因植株農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic characters of ZmMRP-1 transgenic plant

在基因轉錄水平的調節(jié)中，基因的啟動子是影響轉錄水平進而決定性狀表現(xiàn)的重要因素之一，利用具有特異性調控作用的啟動子和增強子是受體植物外源基因表達效率的關鍵[32]。目前啟動子大致有三類，組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異性啟動子。組成型表達啟動子如水稻Actin1、玉米Ubi、35S等較早應用于植物轉基因工程中，但其往往在所有植物組織中轉錄，時空特異性差，使植物能耗增加，還容易導致基因沉默[33]。一些研究表明，選擇合適的某個組織特異性啟動子可以避免非預期表型的產(chǎn)生，以及降低植物能耗，以保證目的基因在所預期的位置準確高量的表達[34]。在本研究中，目的基因由自身啟動子啟動，在啟動子前方有四個串聯(lián)而成的35S增強子序列，35S增強子只增強鄰近基因的表達，而不改變相鄰基因的特異表達時空性[35-37]，以保證ZmMRP-1基因能夠在粒質量形成的關鍵時期和關鍵的部位高效的表達。對轉基因ZmMRP-1的陽性玉米材料的轉錄檢測，說明它只在授粉后的胚乳過量表達，在授粉后12 d達到峰值。同時，陽性玉米材料的農(nóng)藝性狀與陰性對照沒有顯著差別，也間接說明轉ZmMRP-1基因沒有干擾其他部位的發(fā)育。

本研究利用轉基因的方法，成功獲得了過表達ZmMRP-1基因單拷貝株系，通過提高粒長、粒寬、百粒質量等方式，進而改良了玉米產(chǎn)量相關性狀，但由于轉基因受體為A188自交系，其植株矮小，產(chǎn)量較低，不能直接用于玉米高產(chǎn)雜交育種親本。需要將該轉基因材料回交導入骨干自交系中，進一步鑒定過表達ZmMRP-1基因的增產(chǎn)效應，然后作為玉米高產(chǎn)育種的基礎材料。