王鐵兵,王 鵬,蔣建軍,王 芳

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州 730070)

玉米(Zeamays)是具有糧、經(jīng)、果、飼、能等多種用途的重要農(nóng)作物之一，就種植面積而言已經(jīng)是中國第一大作物，其總產(chǎn)的增加對全國糧食增產(chǎn)貢獻率位居各大糧食作物之首，可見其增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)關系到國計民生。但隨著氣候變暖、耕作制度改變和單一品種大面積種植，病蟲害發(fā)生流行嚴重影響了玉米的穩(wěn)產(chǎn)[1]。

瘤黑粉病(Ustilagomaydis)是玉米大田生產(chǎn)的病害之一，世界上100多個國家和地區(qū)均有發(fā)生，它是一種由真菌引起的侵害幼嫩組織的局部性病害，發(fā)病極為普遍[2]。有研究表明，在18世紀時人們發(fā)現(xiàn)導致植物發(fā)病的直接原因為活體真菌玉米黑粉菌[3]。被黑粉菌侵染的玉米組織受其代謝產(chǎn)物刺激而產(chǎn)生大小不一、形狀各異的菌瘤，初生菌瘤多為白色或者淡黃色并由表皮組織形成的薄膜所包被，后期所形成的黑粉瘤消耗大量的養(yǎng)分，導致植株空稈不結(jié)實，造成嚴重減產(chǎn)[4-5]。在美國，瘤黑粉病導致玉米每年減產(chǎn)1%至5%，并且流行年份不低于10%；在德國，田間自然發(fā)病率1%至3%，1976年發(fā)病率甚至超過了50%，使玉米產(chǎn)量損失嚴重[6-7]。在中國，由于推廣的玉米品種中缺少抗瘤黑粉病的品種，加上連年連作，秸稈還田，土壤中黑粉菌的厚垣孢子大量積累，致使玉米瘤黑粉病在東北、華北和黃準海等玉米主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[8]。2000年中國內(nèi)蒙古曾經(jīng)發(fā)生過該病害，當時田間發(fā)病率約20%，部分地塊甚至絕收；2012年在東北和華北等玉米主產(chǎn)區(qū)，大約有7.2×105hm2玉米感染瘤黑粉病[3,9]。玉米被黑粉菌侵染發(fā)病后，一般沒有有效的挽救措施，而積極培育和不斷挖掘開創(chuàng)抗病品種才是重中之重。種植抗病品種是防治該病害最經(jīng)濟最有效的途徑，據(jù)報道，國內(nèi)外很多學者對瘤黑粉病進行了研究與分析，楊克澤等[10]利用藥劑對種子進行包衣防瘤黑粉病處理，發(fā)現(xiàn)28%滅菌唑和24%噻呋酰胺具有良好的防治效果；姜曉穎等[11]對中國東北地區(qū)21個主要玉米自交系進行瘤黑粉病抗性評價，發(fā)掘出‘沈139’等9個高抗自交系；嚴理等[12]對不同用途的22個玉米品種進行瘤黑粉病抗性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糯玉米全為抗性，其次是飼用玉米抗性較好，甜玉米抗性最弱；白金鎧等[13]研究發(fā)現(xiàn)抗瘤黑粉病的自交系較多，雜交種中則較少；Lubberstedt等[14]采用RFLP標記法對玉米進行瘤黑粉病進行QTLs分析，檢測到5～10個QTLs；Ding等[15]利用‘綜3’和‘87-1’構(gòu)建的重組自交系發(fā)現(xiàn)，抗瘤黑粉病基因與環(huán)境互作效應明顯。目前，雖然篩選出了一些抗病的種質(zhì)資源，但是這些種質(zhì)資源的遺傳背景尚未得到進一步分析。SSR具有豐富的多態(tài)性、良好的穩(wěn)定性、操作簡單等優(yōu)點，廣泛應用于玉米、水稻、小麥等農(nóng)作物的種質(zhì)資源親緣關系分析，遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究[16]。因此，本研究對30份玉米種質(zhì)資源進行瘤黑粉病的抗性鑒定，并對其遺傳背景進行SSR分析，以期篩選出抗瘤黑粉病的育種材料，為玉米抗瘤黑粉病基因發(fā)掘與種質(zhì)改良工作提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

‘KYS旱17-9’‘C0343’和‘KYN01’等32份玉米自交系為材料，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學平?jīng)鲇衩子N站自選提供(表1)。

表1 供試玉米自交系名稱Table 1 Maize inbred lines

1.2 試驗地點與田間設計

試驗于2018年在甘肅省定西市安定區(qū)鳳翔鎮(zhèn)進行(E 104°62′，N 35°58′)，該地區(qū)光能豐富，雨熱同季(主要集中在6、7、8月)，無霜期 140 d左右，年平均日照時數(shù)2 500 h，2018年降雨量479 mm，其中6、7月份的降雨量197.9 mm；2019年降雨量(1-11月)477 mm，其中6、7月份的降雨量183.4 mm。前茬為馬鈴薯。

試驗小區(qū)采取隨機分布，每份材料種植2行，每行留苗25株，重復3次，對照為‘齊319’(高抗)和‘掖478’(高感)，2019年重復鑒定。

1.3 用于鑒定種質(zhì)遺傳資源的SSR引物

引物來源于Maize GDB網(wǎng)站(http://www.maizegdb.org)公布的SSR引物信息情況，選擇分布在玉米10條染色上不同bin的69對SSR標記，由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。

表2 SSR引物名稱與序列Table 2 Name and SSR sequence

(續(xù)表2 Continued table 2)

1.4 供試病原菌與田間接種

秋季從病株上以圖1-B為標準采集瘤黑粉病菌，陰晾風干后放于紙盒內(nèi)保存。采用張春民等[17]的注射法接種，使用時將冬孢子充分碾碎，過40目篩后收集均一菌粉，每25 g菌粉加水1 L，充分攪拌后300目篩網(wǎng)過濾，并對濾液加水補足至1 L，備用(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

接種時期在玉米植株6葉1心期，用注射器吸取制備好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1 mL，見心葉冒液即可，對照組在相同部位注射等量的蒸餾水。

1.5 調(diào)查內(nèi)容及標準

1.5.1 調(diào)查內(nèi)容與抗性等級評價標準 接種第10天和第20天進行田間發(fā)病情況調(diào)查。調(diào)查項目包括：每系總株數(shù)、發(fā)病株數(shù)、發(fā)病率(以第20天的調(diào)查發(fā)病率結(jié)果進行抗性等級評價)。玉米瘤黑粉病抗性鑒定依據(jù)《玉米抗病蟲性鑒定技術規(guī)范》(國家行業(yè)標準)進行評價[18]，其具體劃分為1-9級：1級為高抗(HR)，病株率為0～ 1.0%；3級為抗病(R)，病株率為1.1%～ 10.0%；5級為中抗(MR)，病株率為10.1%～ 20.0%；7級為感(S)，病株率為20.1%～40.0%；9級為高感(HS)，病株率為40.1%～100%。

1.5.2 DNA的提取與PCR擴增 在玉米3葉1心時取玉米葉片貯藏在-80 ℃冰箱中備用，采用CTAB法提取DNA[19]；SSR分子標記的PCR反應體系為：(1)2×TaqPCR Master Mix 5 μL；(2)上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；(3)模板DNA(50 ng/μL)2 μL；(4)滅菌超純水2 μL，總體積為10 μL。PCR擴增程序為：(1)95 ℃預變性 5 min；(2)94 ℃變性30 s，50～59 ℃退火30 s， 72 ℃延伸40 s；(3)步驟“(2)”進行35個循環(huán)；(4) 72 ℃延伸10 min。用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增后的PCR產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果如圖2所示。

圖1 玉米瘤黑粉典型照片F(xiàn)ig.1 Typical photo of Ustilago maydis

圖2 SSR引物umc1555和nc130凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of SSR primers umc1555 and nc130

2 結(jié)果與分析

2.1 不同玉米品種的發(fā)病率情況

由表3可知，對6葉1心期的玉米幼苗在接種黑粉菌后的第10天，都表現(xiàn)出瘤黑粉病的癥狀。30份材料的發(fā)病率情況不同，發(fā)病率為 3.33%～53.33%， ‘鋒967-2硬長’的發(fā)病率最低，為3.33%；‘XZX674-2半’發(fā)病率最高，為 53.33%。在接種后的第20天，所有材料都發(fā)病，并進入發(fā)病增速期，發(fā)病率為10.00%～ 86.67%，‘鋒967-2硬長’的發(fā)病率最低，為 10.00%，‘10玉1172-1’發(fā)病率最高，達86.67%。在接種后的第20天，發(fā)病率≥50%的有13份材料，占供試材料的40.63%，此后發(fā)病率沒有增長。

表3 不同玉米材料發(fā)病率情況Table 3 Incidence of different maize varieties

2.2 不同玉米品種的發(fā)病株率與抗性等級

在接種后的第20天，通過30份玉米種質(zhì)資源對瘤黑粉的田間抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，不同玉米種質(zhì)對玉米瘤黑粉病具有不同程度的抗性(表4)，其中‘鋒967-2硬長’表現(xiàn)為抗瘤黑粉病，占供試 材料的3.33%； ‘XZX5221-1’‘Q6196-6-1-1’‘10ZX-1418張’‘FN296-2’‘FN119-5’和‘10玉39’表現(xiàn)為中抗瘤黑粉病，占20.00%；‘KYN01’‘Q529-1-2長’‘XFN無名13-3’‘Q6193-3-14’‘FN95-1馬’‘FN25-2硬’‘Q6193-3-1-2’‘Q416-1-21’和‘10HN17’表現(xiàn)為感瘤黑粉病，占 23.33%；‘KYS旱17-9’‘C0343’‘FN張’‘XZX513’‘10ZX123’‘10H101445’‘10玉1172-1’‘FNA30-1半’‘Q518-22S’‘26193-3-1-2’‘10ZX869-11’‘1048-2硬長’‘XZX674-2半’和‘10HN1383-11硬’表現(xiàn)為高感瘤黑粉病，占 46.67%。其中，‘鋒967-2硬長’的抗性最高，‘10玉1172-1’的抗性最弱。

表4 不同品系玉米的發(fā)病株率與抗性等級Table 4 Incidence and resistance levels of different strains of maize

2.3 SSR分子標記的多態(tài)性

篩選出具有多態(tài)性且擴增條帶良好的69對SSR引物，對32份玉米種質(zhì)資源擴增結(jié)果進行統(tǒng)計分析(表5)。共檢測到272個等位基因，等位變異幅度為3～6，平均每個標記3.64個，引物phi109275和umc1555檢測到的變異最多為6個，引物phi227562、phi046和phi072等檢測到的變異位點最少為3個。多態(tài)性信息量為0.435～0.846，平均0.764，其中引物 umc1196最大，為0.846；引物umc1545最小，為0.245。

表5 69對SSR引物多樣性統(tǒng)計Table 5 Diversity statistics of 69 SSR markers

2.4 聚類分析

由圖3可知，對30份玉米種質(zhì)資源與‘齊319’和‘掖478’進行遺傳聚類分析可知，32份種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.615～1.000。當遺傳相似系數(shù)為0.643時，將32份玉米種質(zhì)資源分為 4類，第Ⅰ類19份材料，其中包括1份高抗材料‘齊319’，1份抗病材料‘鋒967-2硬長’‘XZX5221-1’‘Q6196-6-1-1’和‘10ZX-1418張’等6份中抗材料；第Ⅱ類有7份材料，其中有6份感病材料和1份高感病材料‘掖478’；第Ⅲ類和第Ⅳ類各含有3份材料，均為高感材料。

3 討論與結(jié)論

育種材料的抗病性鑒定，對育種效率的提高和種質(zhì)資源的利用具有重要意義，因此國內(nèi)外的玉米育種專家十分重視種質(zhì)資源的收集，不斷挖掘新的抗病材料，以滿足玉米抗瘤黑粉病育種的需求，從而為培育出更有針對性的新品種，防止病害的廣泛流行奠定基礎[21]。本研究采用多年的鑒定方法，所鑒定出的抗性種質(zhì)對應用于育種生產(chǎn)有更高價值。研究篩選鑒定出7份抗瘤黑粉病的種質(zhì)材料，其中‘鋒967-2硬長’的抗性最好，達到抗病水平；鑒定得到的7份抗性材料可為抗病基因定位、克隆等更進一步的研究提供基礎材料，并為抗瘤黑粉病品種的培育提供可選擇抗源，從而拓寬抗瘤黑粉病種質(zhì)資源的遺傳背景。例如可以配制‘鋒967-2硬長’ב10玉1172-1’的雜交組合，利用雜種優(yōu)勢選育出抗病品種，且隨著抗性的進一步穩(wěn)定與提高，可以作為一個比較好的抗瘤黑粉病的品種。此次鑒定表明，感病材料所占比例明顯高于抗病材料，這與嚴理等[12]對玉米品種對瘤黑粉病抗性的鑒定結(jié)果一致。要得到高抗種質(zhì)，除大范圍收集與篩選高抗種質(zhì)外，還可通過種質(zhì)創(chuàng)新或改良，解決現(xiàn)有種質(zhì)資源中抗病種質(zhì)匱乏的限制，打破抗源單一遺傳背景的現(xiàn)狀，以實現(xiàn)對玉米瘤黑粉病的有效控制。目前，中國玉米種質(zhì)資源雖然豐富，但沒有發(fā)現(xiàn)對瘤黑粉病完全免疫的材料。因此發(fā)掘新的抗瘤黑粉病的種質(zhì)材料，并對這些種質(zhì)材料的抗病性等進行明確劃分顯得尤為重要[19]。

種質(zhì)資源親緣關系的研究是種質(zhì)資源利用的必要前提，豐富的遺傳資源是玉米育種的基礎，確定種質(zhì)資源的遺傳多樣性程度和親緣關系遠近是育種的關鍵，遺傳的同源性越低，遺傳基礎越寬，對雜交育種越有利，使玉米育種材料選育和推廣更有針對性。SSR標記具有信息量豐富、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，已成為遺傳育種和資源分類研究中應用最廣泛的分子標記[22-24]，這對指導合理劃分優(yōu)勢群體，建立相應的雜交育種模式，提高玉米抗瘤黑粉病育種效率具有重要意義。張思奇等[25]對59份玉米種質(zhì)進行穗腐菌的抗性評價，并利用6對SSR將59份玉米種質(zhì)劃分為8個組群，第1類群體中含有的4份種質(zhì)，均為抗病；陳永坤等[26]對64份玉米自交系進行粗縮病的抗性鑒定，采用70對SSR引物對64份玉米自交系進行聚類分析，將供試自交系劃分為 6個群體，其中第1和第4類群中含有的抗病自交系較多；王艷梅等[27]對中國40份玉米自交系進行絲黑穗病的抗性鑒定，采用57對SSR引物對40份自交系進行聚類分析，將40份自交系分為5類，抗病材料主要集中在第5類群。對于玉米瘤黑粉病抗性鑒定的種質(zhì)進行聚類分析的研究未見相關報道，本試驗利用69對 SSR引物對2個標準測驗種和30份材料進行聚類分析，將32份玉米種質(zhì)資源在遺傳相似系數(shù)為0.643時分為 4類，說明這些材料有比較豐富的遺傳變異，對抗病育種的選擇和利用提供有效的參考信息。但抗瘤黑粉病的種質(zhì)材料全部集中在第Ⅰ類，這些抗性材料遺傳基礎狹窄，距離差異小。這主要是因為品種選育過程中所用親本使用過度，育種材料的遺傳差異很小，親緣關系較近，導致了大田生產(chǎn)中所用的抗瘤黑粉病品種的遺傳背景狹窄[16]，對環(huán)境的適應力和對病害的抵抗力下降。所以在抗病育種過程中，要深入挖掘種質(zhì)資源的親緣關系，減少使用親緣關系較近的材料作為親本，應該利用不同遺傳背景的材料作為親本，以增強品種對環(huán)境的適應能力，提高其對病害的抵抗力。

利用SSR分子標記研究玉米種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可對育種方法提供參考信息，為提高育種歷程提供可靠的分子依據(jù)。胡德分等[28]采用61對SSR引物在84份玉米材料中擴增出622個等位基因位點，平均每對引物檢測到的等位基因位點為10.23個，多態(tài)性信息含量平均為0.779；陳波[29]以30份特異玉米地方品種和 2份玉米骨干自交系為材料，用83對SSR引物共檢測出475個等位基因，平均每對引物檢測到的等位基因位點為10.1個，多態(tài)性信息含量平均為 0.626；趙旭等[30]用70對SSR引物在96份玉米材料和6個國內(nèi)通用的標準測驗種中擴增出213個等位基因位點，平均每對引物檢測到的等位基因位點為3.610個，多態(tài)性信息含量平均為0.670。本試驗采用69對SSR引物對32份種質(zhì)資源進行擴增，一共分析篩選出272個等位基因，平均每個標記3.64個，多態(tài)性信息量為0.435～0.846，平均 0.764，相比以上研究，本研究所檢測到的多態(tài)性信息量較為豐富，表明本試驗所用的種質(zhì)材料遺傳多樣性較高，可為抗瘤黑粉病的品種選育等研究提供參考。