胡驍飛 李燕虹 邢云瑞 胡思宇 孫亞寧 邢廣旭 鄧瑞廣 張改平,4,*

(1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 河南 洛陽(yáng) 471003； 3河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；4河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

大豆及其制品含有豐富的蛋白質(zhì)資源，且營(yíng)養(yǎng)成分利用效率高，是人類和動(dòng)物的重要食品原料及飼料加工原料。但大豆中含有多種致敏蛋白和抗?fàn)I養(yǎng)因子，這些物質(zhì)的存在會(huì)影響大豆的有效利用[1]。大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)就是其中一種重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子[2]。SBA是一種能與N-乙酰基D-半乳糖胺/D-半乳糖特異性結(jié)合、分子量約為120 kDa的糖蛋白[3-4]。SBA具有凝集紅細(xì)胞和促分裂的生物學(xué)活性，通過(guò)小腸上皮刷狀緣進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)誘發(fā)免疫反應(yīng)[5-6]，引起動(dòng)物小腸黏膜損傷、絨毛萎縮，胰腺增生，致使動(dòng)物體蛋白分解增強(qiáng)，內(nèi)源氮損失增加[7-9]。日糧中的SBA可以引起動(dòng)物腹瀉，導(dǎo)致生長(zhǎng)速度下降，體重減輕，甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡，嚴(yán)重威脅動(dòng)物尤其是幼齡動(dòng)物的健康生長(zhǎng)與生命安全[10-11]。

為監(jiān)控SBA的存在，減少其對(duì)動(dòng)物的危害，科研人員建立了多種SBA的測(cè)定方法，如紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)[12]、免疫火箭電泳[13]及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等方法[14-15]。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)中紅細(xì)胞來(lái)源會(huì)影響試驗(yàn)的靈敏性，若紅細(xì)胞選擇不合理則檢測(cè)靈敏性較低，而且紅細(xì)胞來(lái)源不同可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較差[16-17]。免疫火箭電泳法操作比較復(fù)雜，且需要特殊的儀器設(shè)備，不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，難以推廣。與其他方法相比，ELISA檢測(cè)方法[14]縮短了檢測(cè)時(shí)間，但由于SBA是大分子蛋白質(zhì)，含有多個(gè)抗原決定簇，因此更適合采用雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。另外，多克隆抗體的成分不均一，采用多抗血清建立SBA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，其準(zhǔn)確性與重復(fù)性較低；而單克隆抗體成分比較均一，且性能比多克隆抗體穩(wěn)定，利用兩種單克隆抗體或至少一種單克隆抗體與一種多克隆抗體進(jìn)行配對(duì)建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，其性能較穩(wěn)定，且準(zhǔn)確性及重復(fù)性較好[18-19]。張海全[15]制備出了SBA單克隆抗體，利用紅細(xì)胞膜對(duì)SBA特異性吸附的性能，結(jié)合所制備的單抗建立了相當(dāng)于雙抗夾心ELISA的SBA檢測(cè)方法，比間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。但由于紅細(xì)胞膜來(lái)源及制備時(shí)的純凈度不確定，且易受試驗(yàn)中試劑性質(zhì)的影響，這種試劑盒檢測(cè)的穩(wěn)定性及重復(fù)性相對(duì)較差。ELISA檢測(cè)耗時(shí)通常在2 h以上，還需酶標(biāo)儀來(lái)讀值，不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。廣大食品生產(chǎn)及飼料加工、動(dòng)物養(yǎng)殖企業(yè)迫切需要更簡(jiǎn)單快速的SBA檢測(cè)方法?；谀z體金標(biāo)記技術(shù)及免疫測(cè)流層析技術(shù)建立的快速檢測(cè)試紙是目前食品飼料安全監(jiān)控檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，由于其簡(jiǎn)單快速，且符合我國(guó)食品安全快速篩查的要求，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥[20]、獸藥[21]、霉菌毒素[22]、細(xì)菌病毒[23]及過(guò)敏原等的檢測(cè)[19]。試紙制備過(guò)程中由于需要抗體與膠體金或量子點(diǎn)結(jié)合，影響抗體生物活性，因此同一種抗體試紙目測(cè)靈敏性應(yīng)遠(yuǎn)低于試劑盒靈敏性[24]。通常情況下，抗體親和力越高，則靈敏性越好。為了研制準(zhǔn)確率高、重復(fù)性好、靈敏性高的SBA免疫學(xué)檢測(cè)試紙，必須研制高靈敏、高親和力的SBA單克隆抗體。

本試驗(yàn)擬采用低劑量、多次免疫的方法，通過(guò)免疫小鼠、細(xì)胞融合及陽(yáng)性雜交瘤篩選技術(shù)，篩選制備出親和力高、靈敏性好、特異性強(qiáng)的SBA單克隆抗體，以期為建立穩(wěn)定靈敏的SBA免疫學(xué)檢測(cè)方法提供可靠的抗體保障，為大豆及其制品中SBA的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SBA，大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子(kunitz trypsin inhibitor，KTI)，大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(bowman-birk trypsin inhibitor，BBI)，大豆球蛋白(glycinin)，β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)，弗氏完全佐劑(freund’s complete adjuvant， FCA)，弗氏不完全佐劑(freund’s incomplete adjuvant，F(xiàn)IC)，mAb分型試劑，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine)培養(yǎng)基，HT(hypoxanthine-thymidine)培養(yǎng)基，RPMI-1640，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)蛋白Marker，酶標(biāo)羊抗鼠IgG抗體(GaMIgG-HRP)，硝酸纖維(nitrocellulose，NC)膜，購(gòu)自索萊寶(北京)生物科技公司。ELISA包被液[0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution，CBS)]，稀釋液[0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)]，封閉液[含5%脫脂奶的PBST(含0.05% Tween-20的PBS)溶液]，顯色液[磷酸-檸檬酸緩沖液(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)]，終止包被液(2 mol·L-1的H2SO4溶液)等溶液均由實(shí)驗(yàn)室配置。其他試劑均為市售分析級(jí)試劑。

6～8周齡潔凈級(jí)雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠NS0骨髓瘤細(xì)胞由英國(guó)國(guó)家動(dòng)物健康研究院惠贈(zèng)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TMQC型臺(tái)式高壓蒸汽滅菌器，新華醫(yī)療器械有限公司；iMark 450/550酶標(biāo)儀、Trans-Blot轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；BCM-1000A型生物潔凈工作臺(tái)，AIRTECH蘇凈安泰有限公司；DMI 3000型倒置生物顯微鏡，德國(guó)Leica光學(xué)儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠免疫 取4只健康雌性BALB/c小鼠，以50 μg SBA蛋白/200 μL乳化液/只的劑量免疫小鼠，共免疫4次，免疫間隔21 d。首次免疫，取500 mg·L-1SBA溶液600 μL，加入等體積的FCA(考慮乳化過(guò)程免疫原的損失，因此增加50%的量)，完全乳化后背部皮下4～6點(diǎn)注射。后3次強(qiáng)化免疫，用FIA替代FCA，其他條件不變。

1.3.2 多抗血清鑒定 第4次免疫10 d后，小鼠斷尾采血，制備多抗血清，采用ELISA方法對(duì)血清效價(jià)及靈敏性進(jìn)行測(cè)定[18]。間接ELISA測(cè)定效價(jià)時(shí)，以滿足P≥0.2且P/N值≥2.1條件時(shí)，最小P值對(duì)應(yīng)的血清稀釋倍數(shù)為血清效價(jià)，其中P為陽(yáng)性孔OD450值，N為陰性孔(陰性孔中加入未經(jīng)SBA免疫的小鼠血清)OD450值。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA與間接ELISA步驟有所不同，首先將含2 500、2 000、1 500、1 000、500、250、125和0 μg·L-1的SBA標(biāo)準(zhǔn)液各50 μL分別加入包被有SBA的酶標(biāo)板孔中，然后每孔加入50 μL效價(jià)測(cè)定時(shí)OD450值為1.0左右的血清稀釋液，其余步驟與間接ELISA一致，根據(jù)酶標(biāo)儀讀值，以B/B0(B為不同濃度SBA對(duì)應(yīng)的OD450值，B0為0 μg·L-1SBA對(duì)應(yīng)的OD450值)為縱坐標(biāo)，SBA濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)建立抑制曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50)，以此衡量血清靈敏性。選取血清效價(jià)高，靈敏性好的小鼠作為細(xì)胞融合小鼠。

1.3.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立 細(xì)胞融合前3 d，對(duì)篩選用來(lái)融合的小鼠進(jìn)行超強(qiáng)免疫1次，腹腔注射200 μL含50 μg SBA滅菌PBS溶液。抻頸處死超免小鼠，70%酒精浸泡5 min，超凈臺(tái)無(wú)菌取出小鼠脾臟，并與提前復(fù)蘇培養(yǎng)的NS0細(xì)胞進(jìn)行融合，將融合后的細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，7～10 d(根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況)后取上清液，進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤篩選。具體細(xì)胞融合步驟及陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選過(guò)程參照文獻(xiàn)[25-26]的方法進(jìn)行。

1.3.4 SBA mAb大量制備 采用體內(nèi)誘生腹水法大量制備SBA mAb。將0.5 mL/只滅菌液體石蠟注射到小鼠腹腔中，7 d后，用RMPI-1640稀釋陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞至1×106個(gè)·mL-1，以0.5 mL/只的劑量注射入上述小鼠腹腔內(nèi)。觀察小鼠腹部腫脹情況，待腹部腫脹明顯時(shí)采集腹水，將腹水5 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀留上清，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 SBA mAb免疫學(xué)特性鑒定

效價(jià)測(cè)定：間接ELISA方法測(cè)定SBA mAb效價(jià)。

亞型鑒定：按照Sigma鼠源mAb分型試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

親和力常數(shù)(Ka)測(cè)定：ELISA飽和法測(cè)定[24]，根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算：

Ka=(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)

(1)

式中，n為[Ag]t與[Ag’]t的比值；[Ag]t、[Ag’]t為不同包被濃度；[Ab]t、[Ab’]t為2個(gè)不同包被濃度下抗體50%半飽和對(duì)應(yīng)的濃度。

特異性鑒定：交叉反應(yīng)率測(cè)定，將glycinin、β-conglycinin、BBI、KTI作為抑制劑，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定IC50，計(jì)算交叉反應(yīng)率[(cross reaction rate, CR)CR=SBA的IC50/其他競(jìng)爭(zhēng)物的IC50×100%][27]。Western blot鑒定，將glycinin、β-conglycinin、BBI、KTI分別以相同的濃度及體積加入SDS-PAGE凝膠泳道中(每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù))，電泳結(jié)束后一部分用于考馬斯亮藍(lán)染色并脫色觀察；另一部分轉(zhuǎn)膜后，加入抗體于37℃條件下孵育2 h，經(jīng)PBST洗滌30 min，再于室溫下與酶標(biāo)二抗GaMIgG-HRP結(jié)合2 h，經(jīng)PBST洗滌后超免ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，將顯色結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，判斷SBA mAb的特異性[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠多抗血清的鑒定

由表1可知，經(jīng)過(guò)4次免疫， 4只小鼠免疫效果良好，均產(chǎn)生了SBA抗體，效價(jià)均在1∶6 400 以上，其中1、2、3號(hào)小鼠效價(jià)均達(dá)到1∶12 800以上。

表1 多抗血清效價(jià)的間接ELISA測(cè)定結(jié)果Table 1 Titer of mouse antiserum detected by indirect ELISA

4只免疫小鼠產(chǎn)生的抗體，均可以被SBA抑制，其中1號(hào)小鼠抑制效果最好(圖1)。根據(jù)1號(hào)小鼠多抗血清抑制曲線計(jì)算其IC50為571.4 μg·L-1。說(shuō)明本研究采用的SBA免疫劑量、免疫方式是成功的。

2.2 SBA mAb的制備及特性鑒定

根據(jù)免疫小鼠多抗血清效價(jià)及靈敏性鑒定結(jié)果，選擇血清效價(jià)高、靈敏性好的1號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)過(guò)有限稀釋亞克隆，最終得到1株能穩(wěn)定分泌抗SBA單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，命名為5B4E10。通過(guò)小鼠體內(nèi)誘生腹水法批量制備出SBA單克隆抗體。

2.2.1 SBA mAb效價(jià) 由表2可知，所制備的SBA單抗抗體效價(jià)比較高，達(dá)到1∶409 600以上。

圖1 1號(hào)小鼠血清的抑制曲線Fig.1 Serum inhibitive curve of No.1 mouse

表2 SBA mAb效價(jià)測(cè)定Table 2 Determination of the titer of SBA mAb

2.2.2 SBA mAb亞型 SBA mAb亞型鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，制備的SBA mAb亞型為IgG1型。

2.2.3 SBA mAb親和力 SBA mAb的親和力曲線見(jiàn)圖3。經(jīng)計(jì)算，與5 和2.5 mg·L-1濃度的SBA抗原結(jié)合并達(dá)到50%飽和狀態(tài)時(shí)所對(duì)應(yīng)SBA mAb濃度分別為739.55 和415.40 μg·L-1，根據(jù)公式計(jì)算Ka為1.83×109L·mol-1，而一般認(rèn)為Ka介于107～1012L·mol-1時(shí)屬于高親和力抗體[28]，親和力越高，說(shuō)明以此抗體制備的檢測(cè)產(chǎn)品靈敏性越好。

圖2 SBA mAb亞型鑒定Fig.2 Identification of subtype of SBA mAb

圖3 SBA mAb親和力曲線Fig.3 Affinity curve of SBA mAb

2.2.4 SBA mAb靈敏性 SBA mAb靈敏性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。抑制回歸曲線方程為y=-0.329 8x+1.131 2，R2=0.979 5，由回歸曲線計(jì)算IC50為82.04 μg·L-1。說(shuō)明SBA mAb具有很高的靈敏性。這可能是由于抗體的親和力比較高，更易與靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合。

圖4 SBA mAb的抑制曲線Fig.4 Inhibitive curve of SBA mAb

2.2.5 SBA mAb特異性 由表3可知，SB mAb與glycinin、β-conglycinin、BBI、KTI的CR均小于1%，說(shuō)明4種競(jìng)爭(zhēng)物與SBA mAb無(wú)交叉反應(yīng)性，SBA mAb的特異性比較強(qiáng)。

表3 SBA mAb的交叉反應(yīng)結(jié)果Table 3 The cross-reactivity of SBA mAb

由圖5-A可知，SDS凝膠電泳時(shí)，大豆過(guò)敏原glycinin及β-conglycinin，抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)SBA、BBI、KTI均有條帶出現(xiàn)，說(shuō)明膠片上有該種物質(zhì)存在。由圖5-B可知，SDS凝膠電泳膠片轉(zhuǎn)膜到NC膜上與SBA mAb反應(yīng)時(shí)，只有SBA條帶還存在，而glycinin、β-conglycinin、BBI及KTI的條帶均消失，說(shuō)明SBA mAb只能與SBA結(jié)合，不與其他4種物質(zhì)結(jié)合，進(jìn)一步證明了SBA mAb的特異性較強(qiáng)。

Note: 1: Marker. 2: glycinin. 3: β-conglycinin. 4: BSA. 5: BBI. 6: KTI.圖5 SBA mAb Western blot鑒定Fig.5 Western blot identification of SBA mAb

3 討論

SBA分子量約120 kDa，屬于大分子抗原物質(zhì)，與農(nóng)藥、獸藥、霉菌毒素等小分子半抗原物質(zhì)不同，小分子半抗原必需與載體蛋白偶聯(lián)形成人工完全抗原才能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體[21, 29-30]。 而SBA不需要與載體蛋白偶聯(lián)就可以直接刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，因此本試驗(yàn)直接將SBA經(jīng)過(guò)乳化后免疫動(dòng)物用來(lái)制備抗體。有研究用大豆球蛋白glycinnin和β-conglycinin直接免疫小鼠和兔子成功制備出了二者的單克隆抗體和多克隆抗體[25]。

抗原免疫劑量并非越高越好，大劑量免疫不但浪費(fèi)抗原增加成本，而且所制備抗體的效價(jià)及靈敏性并不一定比低劑量組高[31-32]。王耀[25]以50 μg SBA蛋白劑量用glycinin和β-conglycinin免疫小鼠，取得了良好的免疫效果；本研究同樣用50 μg SBA蛋白的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，所用劑量比張海全[15]研究選用劑量低60%，但本研究制備的單抗親和力常數(shù)(Ka)比張海全[15]制備的單克隆抗體高出近兩個(gè)數(shù)量級(jí)(109∶107)，這可能是由于本研究采用4次免疫，而張海全[15]的研究選用的是3次免疫，表明低劑量、多頻次免疫可能更利于高親和力抗體形成。親和力高的抗體，其靈敏性也較好，本研究中所制備單抗敏感性較好，其IC50為82.04 μg·L-1，而張海全[15]報(bào)道中未提及抗體靈敏性，如果從抗體的親和力來(lái)推算，本研究制備抗體的靈敏性更好一些，而親和力高、靈敏性好的單抗更易于制備出高靈敏的免疫學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品。本研究制備的抗體亞型為IgG1型，張海全[15]制備的SBA單克隆抗體亞型是IgG2型，二者之所以不同，可能是由SBA免疫劑量、免疫次數(shù)及免疫間隔不同引起的，張海全[15]所用SBA免疫劑量為80 μg蛋白，免疫間隔為28 d，免疫3次；而本研究所用SBA免疫劑量為50 μg蛋白，免疫間隔21 d，免疫4次。本研究制備的SBA抗體亞型與王耀[25]制備的glycinin 和β-conglycinin抗體亞型一致，均為IgG1型，而兩項(xiàng)研究除了靶標(biāo)不同外，所采用的免疫劑量、免疫間隔及免疫次數(shù)均相同。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)將純化的SBA免疫BALB/c小鼠，在鑒定小鼠多抗血清效價(jià)和靈敏性的基礎(chǔ)上，選擇效價(jià)和靈敏性較優(yōu)的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，陽(yáng)性雜交瘤篩選，有限稀釋亞克隆成功，從而得到1株能分泌抗SBA單克隆抗體的穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞株5B4E10，其分泌的SBA mAb效價(jià)達(dá)到1∶409 600以上，亞型為IgG1型，Ka為1.83×109L·mol-1，且只與SBA特異性結(jié)合，而不與其他大豆過(guò)敏原或抗?fàn)I養(yǎng)因子結(jié)合。本試驗(yàn)制備出了免疫學(xué)特性良好的SBA單克隆抗體，為建立大豆及其制品中SBA的高靈敏免疫學(xué)檢測(cè)方法奠定了良好的基礎(chǔ)。