王曼曼 屈淑平 黃河勛 薛舒丹 吳廷全 李俊星 戴祖云 鐘玉娟,*

(1 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640； 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3 江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 江蘇 南通 226541；4 安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司，安徽 合肥 230000)

中國南瓜(Cucurbitamoschata)是葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(Cucurbita)主要栽培種之一[1]，在全世界范圍內(nèi)廣泛栽培，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[2-3]。果實(shí)品質(zhì)是南瓜分子育種研究關(guān)注的重點(diǎn)，其中糖分作為南瓜果實(shí)甜味口感的來源，其組分和含量是衡量果實(shí)品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[4]。近年來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展，其多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、開發(fā)成本低等優(yōu)勢也日益突顯，分子標(biāo)記技術(shù)在南瓜等葫蘆科作物分子育種過程中的應(yīng)用也越來越廣泛[5-6]。Harel-Beja等[7]以甜瓜品種PI 414723和Dulce為親本構(gòu)建重組自交系，開發(fā)了600對分子標(biāo)記用于遺傳圖譜的構(gòu)建和甜瓜果實(shí)性狀的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)定位，得到3個與果實(shí)可溶性固形物含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分別命名為tss2.1、tss2.2和tss5.1。Hashizume 等[8]以西瓜自交系(H-7)為材料構(gòu)建了 F2和 BC1群體，并開發(fā)了477個隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)標(biāo)記、53個限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)標(biāo)記、23個簡單重復(fù)序列(inter-simple sequence repeat, ISSR)標(biāo)記和1個同工酶標(biāo)記，構(gòu)建了一份高密度的西瓜連鎖圖譜，經(jīng)過遺傳連鎖分析將西瓜糖含量相關(guān)QTL位點(diǎn)定位在8號連鎖群上。Ren等[9]以果實(shí)甜度差異顯著的西瓜材料為親本構(gòu)建了重組自交系(recombinant inbred line，RIL)群體，發(fā)現(xiàn)液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClTST2和細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClSWT是西瓜果實(shí)中轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖、果糖和蔗糖的關(guān)鍵基因，且這2個基因的表達(dá)量均與西瓜果實(shí)含糖量呈正相關(guān)。

含糖量作為南瓜[10-12]、甜瓜[13]等葫蘆科作物重要的品質(zhì)性狀，其相關(guān)研究還很少，且多集中于分析其代謝途徑，Wyatt等[11, 14]以高糖含量(Sweet REBA)和低糖含量(Lady Godiva)的美洲南瓜為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了18個與蔗糖代謝有關(guān)的基因，其中蔗糖磷酸合成酶在蔗糖合成過程中具有較高的酶活性，推測其可能對果實(shí)中蔗糖的合成起調(diào)控作用。本研究前期運(yùn)用高通量測序技術(shù)獲得了一份中國南瓜的高密度遺傳圖譜, 對中國南瓜的含糖量相關(guān)性狀進(jìn)行了初定位，得到了3個與中國南瓜葡萄糖含量、蔗糖含量、蔗糖/葡萄糖含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)[15]，但是目前還未找到控制南瓜果實(shí)含糖量的關(guān)鍵基因。

我國是南瓜消費(fèi)大國。南瓜產(chǎn)業(yè)在我國農(nóng)業(yè)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、現(xiàn)代都市農(nóng)業(yè)以及提高人民生活水平等方面發(fā)揮著重要作用。對南瓜果實(shí)而言，其糖組分及含量是果實(shí)甜度的主要影響因素，南瓜的糖分轉(zhuǎn)化模式與其他作物不同，且南瓜含糖量性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，遺傳主效應(yīng)與環(huán)境存在明顯的互作效應(yīng)，傳統(tǒng)的生理與遺傳學(xué)研究方法很難實(shí)現(xiàn)其遺傳本質(zhì)的深層次分析，主要表現(xiàn)為無法明確在復(fù)雜的糖代謝和糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因網(wǎng)絡(luò)中影響和決定南瓜果實(shí)糖積累的關(guān)鍵基因節(jié)點(diǎn)，更無法針對關(guān)鍵基因開發(fā)標(biāo)記并用于分子標(biāo)記輔助育種，進(jìn)而導(dǎo)致對南瓜含糖量這一核心目標(biāo)性狀的決定機(jī)制認(rèn)識落后、選擇效率低，阻礙了南瓜品質(zhì)改良工作的深入開展。因此，面對日益提高的消費(fèi)需求，通過對南瓜糖分積累分子機(jī)制的研究，結(jié)合高通量篩查技術(shù)，尋找控制南瓜糖含量關(guān)鍵基因，明確南瓜糖的合成調(diào)控作用機(jī)制，對建立高效南瓜品質(zhì)育種分子體系和提高南瓜育種水平具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料中國南瓜CMO-E(P1)和CMO-97(P2)，均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所黃河勛研究員提供。其中CMO-E是由泰國引進(jìn)在廣東多代自交純化的高代自交系，其蔗糖/葡萄糖在0.15～0.28之間，CMO-97是廣東本地的高代自交系，其蔗糖/葡萄糖在7.26～7.66之間。以蔗糖/葡萄糖低的CMO-E作為母本，蔗糖/葡萄糖高的CMO-97作為父本，雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得200株F2分離群體。所有材料均種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地，常規(guī)方法管理，人工雜交授粉。為保證果實(shí)的質(zhì)量，每個單株只保留一個瓜，在果實(shí)達(dá)到商品成熟期時進(jìn)行采摘，用于糖含量的檢測。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 使用CTAB法提取南瓜親本及200株F2群體的基因組DNA，用ND-2000C超微量分光光度計(jì)(Thermo，美國)檢測DNA的濃度和純度， OD260/OD280≥1.8時，稀釋至100 ng·μL-1，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 果實(shí)糖含量的測定及相關(guān)性狀的遺傳分析 待果實(shí)進(jìn)入成熟期后進(jìn)行取樣，將所取新鮮南瓜果肉于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，隨后分批對所取樣品進(jìn)行冷凍干燥處理，將冷凍干燥后的果肉研磨成粉狀，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)技術(shù)測定果實(shí)中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量(每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù))。統(tǒng)計(jì)糖含量的數(shù)據(jù)，并對其進(jìn)行遺傳分析。

1.2.3 蔗糖/葡萄糖初定位區(qū)間(qs/g19-a)分子標(biāo)記開發(fā)及篩選 前期定位結(jié)果顯示蔗糖/葡萄糖QTL初定位區(qū)間(qs/g19-a)位于19號連鎖群107.67～120.30 cM，位于南瓜參考基因組[16]的7號染色體上。結(jié)合參考基因組信息和親本重測序數(shù)據(jù)，使用Primer 5.0軟件在蔗糖/葡萄糖QTL候選區(qū)間內(nèi)均勻設(shè)計(jì)并合成50對InDel引物，利用親本和F1單株進(jìn)行引物篩選，將PCR產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯凝膠上進(jìn)行電泳檢測，將擴(kuò)增條帶清晰且在親本間存在顯著差異的多態(tài)性引物用于F2群體的擴(kuò)增。根據(jù)廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期的高通量測序結(jié)果[15]，找到蔗糖/葡萄糖QTL候選區(qū)間內(nèi)所有單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)及其側(cè)翼序列，用于競爭性等位基因特異性擴(kuò)增(kompetitive allele specific PCR, KASP)標(biāo)記的開發(fā)。利用PARMS SNP在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)KASP引物。每個標(biāo)記包含5條引物，其中2條熒光通用引物包含在PARMS 2X Master Mix中，其余3條為標(biāo)記特異引物；特異引物中，1條為標(biāo)記位點(diǎn)的特異引物(locus specific primer)，另外2條為 SNP等位基因特異引物(allele specific primer)。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為2 ×Es Taq MasterMix 7.5 μL、Primer-F(10 μmol·L-1)0.75 μL、Primer-R(10 μmol·L-1)0.75 μL、DNA 模板(100 ng·μL-1) 2.0 μL、ddH2O 4.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，X℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72℃延伸7 min，于4℃保存(X℃為最佳退火溫度)。

PARMS PCR 反應(yīng)體系為2× PARMS Mix 5 μL、Fa(10 μmol·L-1)0.15 μL、Fb(10 μmol·L-1)0.15 μL、R(10 μmol·L-1)0.15 μL、DNA模板(100 ng·μL-1)1 μL、ddH2O 3.55 μL。KASP PCR 反應(yīng)程序：第一步：94℃變性15 min；第二步：94℃變性20 s，65℃退火1 min，共10個循環(huán)(每個循環(huán)降低 0.8℃)；第三步：94℃變性20 s，57℃退火和延伸1 min，共28個循環(huán)。

1.2.5 遺傳圖譜加密 將篩選后確定的InDel引物和KASP引物在F2群體中擴(kuò)增并統(tǒng)計(jì)其帶型結(jié)果，利用 Joinmap 4.0軟件和MapQTL 5.0軟件，采用完備區(qū)間作圖法，結(jié)合HPLC測定的表型數(shù)據(jù)，對F2群體的蔗糖/葡萄糖性狀重新進(jìn)行QTL作圖和遺傳效應(yīng)分析，以對數(shù)優(yōu)勢比(logarithm of odds, LOD)≥3確定QTL位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本材料糖含量表型特征

由圖1可知，成熟南瓜果實(shí)中的可溶性糖主要為蔗糖、果糖和葡萄糖，在兩親本材料中果糖含量差異較小，蔗糖/葡萄糖差異較為顯著。

圖1 親本CMO-E和CMO-97采收期果實(shí)糖組分和含量HPLC圖Fig.1 HPLC of sugar components and contents in the harvested CMO-E and CMO-97 fruits

2.2 果實(shí)含糖量相關(guān)性狀遺傳分析

利用HPLC法對父母本、F1和F2群體的果實(shí)含糖量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，CMO-E(P1)表現(xiàn)為高葡萄糖低蔗糖含量，CMO-97(P2)表現(xiàn)為高蔗糖低葡萄糖含量。F1果實(shí)中的蔗糖、葡萄糖含量則介于兩親本之間。對F2群體的果實(shí)含糖量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)無論是蔗糖含量還是葡萄糖含量均呈現(xiàn)連續(xù)的近正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀變異特征。

圖2 果實(shí)葡萄糖含量、蔗糖含量在F2群體中的頻數(shù)分布圖Fig.2 Frequency distribution of fruit glucose and sucrose content in F2 population

2.3 蔗糖/葡萄糖QTL候選區(qū)間(qs/g19-a)分子標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)前期初定位的結(jié)果[15]，結(jié)合親本重測序數(shù)據(jù)和南瓜的基因組信息[16]，在qs/g19-a所在的968.77 kb區(qū)間內(nèi)開發(fā)50對InDel標(biāo)記。利用父母本和F1對這50對引物進(jìn)行初步篩選，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和聚丙烯凝膠電泳檢測，得到9對擴(kuò)增效率高、穩(wěn)定性好、條帶清晰(表1)在高蔗糖/葡萄糖和低蔗糖/葡萄糖親本間差異顯著多態(tài)性良好的InDel標(biāo)記(圖3)。用這9對InDel引物在F2群體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，讀取并統(tǒng)計(jì)帶型結(jié)果，用于后續(xù)的遺傳圖譜構(gòu)建(圖4)。

注：從左到右依次為多態(tài)性引物S2、S5、S9、S11、S39、S40、S42、S44和S51在P1、P2和F1中的分型結(jié)果。Note: The polymorphic primers S2, S5, S9, S11, S39, S40, S42, S44 and S51 in P1, P2 and F1 are shown in the figure from left to right.圖3 引物多態(tài)性篩選聚丙烯酰胺凝膠圖Fig.3 Primer polymorphism screening polyacrylamide gel

圖4 InDel引物在部分F2單株中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Results of amplification of InDel primers in partial F2 plants

表1 InDel引物名稱和序列Table 1 InDel primer names and sequences

考慮到在本材料中InDel引物的有效率較低，dCAPS引物酶切成本較高等因素，故又選擇了操作便捷、檢測成本較低的KASP技術(shù)用于進(jìn)一步的標(biāo)記開發(fā)。根據(jù)前期構(gòu)建遺傳圖譜時的SNP分子標(biāo)記信息，從南瓜基因組網(wǎng)站下載包含這些SNP位點(diǎn)的基因序列，利用 SNP Primer在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成。利用這6對KASP引物(表2)對F2單株進(jìn)行基因分型檢測，結(jié)果如圖5所示。

將上述9個 InDel 標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠結(jié)果和6個KASP 標(biāo)記的分型結(jié)果進(jìn)行整理，利用Join Map 4.0和Map QTL 5.0軟件將其與前期的112個SNP標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果顯示127個標(biāo)記全部進(jìn)入19號連鎖群，蔗糖/葡萄糖相關(guān)的QTL (qs/g19-a)定位區(qū)間較之前有明顯縮小，由原來的968.7 kb縮小到356.3 kb，與之緊密連鎖的分子標(biāo)記為Cm558和Cm588(圖6)。

表2 KASP標(biāo)記信息Table 2 KASP maker information

注：圖中每個點(diǎn)對應(yīng)一個F2單株，綠色具有HEX熒光基團(tuán)為父本型(CMO-97)，紅色具有FAMHEX熒光基團(tuán)為雜合型(F1)， 藍(lán)色具有FAM熒光基團(tuán)為母本型(CMO-E)單株，灰色為陰性對照，黑色為缺失；FAM為羧基熒光素，HEX為六氯-6-羧基熒光素。Note: Each point in the figure corresponds to a single F2 plant, the green plant with HEX fluorescent group is a male type (CMO-97), the red plant with FAMHEX fluorescent group is a heterozygous type (F1), the blue plant with FAM fluorescent group is a female type (CMO-E), the gray plant is a negative control, and the black plant is missing. FAM: Carboxyfluorescein. HEX: 6-nexa-choro-Huorescein.圖5 KASP標(biāo)記在F2群體中的基因分型結(jié)果Fig.5 Genotyping results of KASP markers in the F2 population

注：紅色為新添加標(biāo)記。Note: The red markers are newly added.圖6 南瓜果實(shí)蔗糖/葡萄糖的分子標(biāo)記連鎖圖譜及定位區(qū)間候選基因Fig.6 Molecular marker linkage map of sucrose/glucose in pumpkin fruit and candidate gene for location interval

2.4 蔗糖/葡萄糖QTL位點(diǎn)候選基因分析

根據(jù)已經(jīng)公布的南瓜基因組信息(http://cucurbitgenomics.org/search/genome/9)，對比基因注釋信息發(fā)現(xiàn)在qs/g19-a所在的356.3 kb定位區(qū)間內(nèi)共有56個基因，其中8個基因的功能是未知的。結(jié)合前人[17-18]研究進(jìn)展，在剩余的48個基因中，與糖含量相關(guān)的基因共有4個：2個Fructose-1,6-bisphosphatase class 1、1個MYB 轉(zhuǎn)錄因子(MYB transcription factor)基因和1個Myb family transcription factor APL (Myb-like DNA-binding domain，shaqkyf class protein)基因(圖6)。研究發(fā)現(xiàn)，果糖-1，6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase，F(xiàn)BP)的主要作用是通過催化果糖-1,6-二磷酸分解為果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate)和無機(jī)磷(Pi)(此過程不可逆)，參與光合作用調(diào)控糖的合成和代謝進(jìn)程，是蔗糖生物合成中的調(diào)節(jié)酶之一[17-18]。此外，MYB轉(zhuǎn)錄因子主要是通過結(jié)合到糖酵解途徑中單糖轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)基因的啟動子上，對糖的代謝過程產(chǎn)生影響[19-21]。因此，推測以上4個基因可能是影響中國南瓜果實(shí)甜度的候選基因。

3 討論

果實(shí)中可溶性糖含量及其種類是影響果實(shí)風(fēng)味、決定果實(shí)品質(zhì)的關(guān)鍵[22]，成功找到控制果實(shí)糖分積累和代謝的基因?qū)δ瞎瞎麑?shí)品質(zhì)育種至關(guān)重要。隨著人們消費(fèi)習(xí)慣的改變，消費(fèi)者對品質(zhì)的追求日益凸顯。近年來國內(nèi)外大量學(xué)者對果實(shí)含糖量相關(guān)性狀開展了一系列研究，任毅[23]對西瓜遺傳圖譜進(jìn)行整合，得到一張包含1 339個SSR、InDel、SNP和SV標(biāo)記的整合圖譜，共得到60個與糖含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)。結(jié)合其他相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[8, 24]，西瓜果實(shí)中的葡萄糖、果糖、蔗糖和總糖含量不僅受主效基因控制，同時也有微效基因共同起作用；陳銀根[25]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜果實(shí)中的含糖量相關(guān)性狀主要受加性效應(yīng)的影響，其中果糖含量的最適遺傳模型為1對加性-顯性主基因+加性-顯性多基因；甜瓜果實(shí)中含糖量遺傳規(guī)律同黃瓜相似[7]，也受加性效應(yīng)控制；Monforte等[26]以來自西班牙的Piel de Sapo和來自韓國的PI16137593為親本，得到93個 F2和77個DHLs(double haploid lines)群體，并以 F2和DHLs群體為材料構(gòu)建了一張包含107個分子標(biāo)記、12個連鎖群的遺傳圖譜，檢測到5個和可溶性糖含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分別命名為 ssc1.1、ssc2.1、ssc4.1、ssc4.2、ssc8.1；張寧等[27]以甜度差異顯著的甜瓜親本為材料，得到F2群體并構(gòu)建遺傳圖譜，分別在4號和3號連鎖群上得到與甜瓜果實(shí)中果糖含量相關(guān)的QTL Fru4.1和與總糖含量相關(guān)的QTL Ts3.1。本研究利用HPLC技術(shù)測定F2群體的果實(shí)含糖量，相較于傳統(tǒng)的化學(xué)方法盡可能地降低了測定誤差。對含糖量相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)南瓜果實(shí)糖含量的變化是呈連續(xù)的近正態(tài)分布，屬于典型的數(shù)量性狀，受環(huán)境影響較大，與上述其他葫蘆科作物中關(guān)于糖的報(bào)道相一致。

對南瓜等葫蘆科作物果實(shí)中含糖量相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜果實(shí)的蔗糖含量由一個單隱性基因suc決定[28-29]，CmTST2基因是在甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中高度表達(dá)的液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 其過表達(dá)可以增加甜瓜果實(shí)中的糖積累，而CmS-AIV1基因則在甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中參與調(diào)控蔗糖含量的積累[30]；在對西瓜的研究中發(fā)現(xiàn)了與糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ClTST2)和細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ClSWT)[9]；Li等[31]研究發(fā)現(xiàn), 黃瓜蔗糖磷酸合成酶基因CsSPS4C過表達(dá)可以促進(jìn)黃瓜葉片中糖分的積累。目前，還未找到?jīng)Q定南瓜果實(shí)含糖量基因。本研究通過分子標(biāo)記的開發(fā)對遺傳圖譜進(jìn)行了加密，縮小了蔗糖/葡萄糖這一性狀的定位區(qū)間，并通過前人在白菜[18]、擬南芥[32]、馬鈴薯[19]等作物中的研究推測，果糖1,6-二磷酸酶和MYB轉(zhuǎn)錄因子影響植物發(fā)育過程中糖代謝進(jìn)程的基因?yàn)檎崽?葡萄糖性狀的候選基因。縮小蔗糖/葡萄糖這一性狀的QTL定位區(qū)間并對候選基因進(jìn)行合理預(yù)測，為進(jìn)一步明確決定中國南瓜果實(shí)甜度的基因奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過南瓜果實(shí)開發(fā)和篩選分子標(biāo)記，對qs/g19-a所在區(qū)間進(jìn)行了遺傳圖譜加密，縮小了定位區(qū)間，得到了與之緊密連鎖的相關(guān)分子標(biāo)記，為進(jìn)一步確定候選基因提供了理論依據(jù)。篩選分子標(biāo)記的方法也有助于在苗期進(jìn)行高糖含量南瓜幼苗的篩選，以達(dá)到節(jié)省勞動力、提高育種效率的效果。但本研究發(fā)現(xiàn)的QTL僅解釋了糖含量的部分表型變異，還需要構(gòu)建更先進(jìn)的遺傳群體進(jìn)行研究，從而對南瓜果實(shí)中決定果實(shí)甜度的蔗糖/葡萄糖這一性狀進(jìn)行精細(xì)定位，進(jìn)一步縮小候選區(qū)間，找到控制果實(shí)甜度的關(guān)鍵基因。

致謝：本研究得到了廣東省省級現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)園(汕尾市海豐縣蔬菜產(chǎn)業(yè)園)的支持。