李 松 ,陳偉祥,婁燈吉,楊亞麗

(1.玉溪師范學院 化學生物與環(huán)境學院,云南 玉溪 6531001;2.云南佳匯檢測技術有限公司，云南 玉溪 653100)

玉米育種的重要參考之一是選擇遺傳多樣性豐富的玉米種質.近年來，我國玉米育種的種質基礎狹窄成為共識，種質遺傳基礎狹窄已經成為制約我國玉米育種持續(xù)發(fā)展的重要因素[1].這不僅會使我國的玉米育種遇到瓶頸，影響我國玉米育種的質量，還會由于某些病害的潛伏而造成嚴重的農業(yè)生產危害，使我國玉米生產質量下降.因此，我國許多玉米種質研究者都將視線轉移到了地方品種上，因為我國的許多地方品種具有很多優(yōu)良性狀，如抗倒伏、抗干旱、抗病害、容易適應當地環(huán)境等[2].若能最大限度地運用這些地方玉米種質的優(yōu)良性狀，則可以有效地緩解目前玉米育種所遇到的瓶頸壓力.通過反饋作用還可以增強現有玉米群體的遺傳多樣性，形成一個良性的循環(huán).我國的地方種質普遍在山區(qū)保留，特別是貧困山區(qū)，了解該地方的種質遺傳基礎是有效對其利用的前提.

常用的遺傳多樣性研究的方法有：形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記、分子標記[3].常用的分子標記包括限制性片段多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)、 擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、隨機擴增多態(tài)性 DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、內部簡單重復序列(Inter-simple sequence repeat，ISSR)、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)[4，5].SSR與其他分子標記如SNP，AFLP等相比，具有以下優(yōu)點：①簡單重復序列在生物的基因組中隨機的分布，且具有廣泛的遺傳變異位點，能檢測到的多態(tài)性更高.②SSR標記是共顯性標記，可以區(qū)分純合子和雜合子，提供更全面的遺傳信息.③微衛(wèi)星序列的多態(tài)性可以用PCR技術檢測，PCR技術簡便，易掌握[6～8].隨著生物技術的快速發(fā)展，利用分子標記技術進行玉米遺傳多樣性研究得到廣泛運用.王鳳格等[9]利用SSR標記分析328份玉米品種的遺傳多樣性及遺傳分化特點，表明近年來育成品種遺傳多樣指數在不同年份間變化不大，除京津唐組之外在其他區(qū)試組間差異也不大；胡德分等[10]用篩選出的70對SSR引物分析19個云南常用自交系玉米，利用聚類分析可將云南19個自交系劃分為4個類群，表明云南自交系遺傳基礎豐富，多態(tài)性好；楊榮志等[11]利用SSR分子標記技術分析川西高原早熟玉米遺傳多樣性，發(fā)現川西高海拔玉米種質資源相對獨立，遺傳多樣性豐富.

本研究利用農業(yè)標準(NY/T1432-2014)[12]推薦的SSR核心引物，以云南昭通種植的14個玉米品種為研究材料，進行遺傳多樣性分析，闡述不同品種間的遺傳距離，為云南昭通玉米種質資源的選育和推廣提供理論和技術支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為云南省昭通市種植的14個玉米品種(表1).

表1 供試玉米品種

1.2 主要儀器及耗材

主要儀器：CT006248 PCR擴增儀(BIO-RAD)、Powerpac Universal垂直電泳儀(BIO-RAD)、D-37520臺式冷凍離心機(Thermo)、TS-200搖床(QILINVEIER)、膠片觀察燈、微量移液器(Thermo)、 AUTOCLAVE. GI54DW高壓滅菌鍋(ZEALWAY)、 PK-80恒溫水浴鍋(精宏)、 LFPM58-68生物安全柜(Thermo)

主要試劑：植物基因組DNA提取試劑盒(HP Plant DNA Kit)、PCR超混液(D331B)、6×Loading Buffer、瓊脂糖、豐科公司的40%聚丙烯酰胺溶液、尿素、親和硅烷、剝離硅烷、無水乙醇、四甲基乙二胺(TMED)、過硫酸銨、冰醋酸、硝酸銀、甲醛、 DNA Marker、異丙醇、異戊醇、三羥甲基氨基甲烷等.

1.3 試驗方法

樣品DNA的提取：(參照Omega:HP Plant DNA kit操作方法)將14份玉米樣品的種子參照植物基因組DNA提取試劑盒的方法提取各樣品DNA，用50 μL TE溶液溶解后于-20℃儲藏.

PCR擴增：DNA濃度調整至50 ng/μL，用于PCR擴增特異性產物.反應體系為25 μL：模板DNA 2 μL，正、反向引物10 pmol/μL各0.5 μL，Easy Taq Mix 12.5 μL，雙蒸水9.5 μL.PCR擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火35 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，最后4℃保存.

瓊脂糖凝膠電泳檢測：在每個擴增樣品中加入4 μL 6×Loading Buffer或自制Loading Buffer(含二甲苯青)混勻后，用濃度為2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測.

引物篩選：本試驗分別用農業(yè)行業(yè)標準NY/T 1432-2014中推薦的40 對核心引物，用每種引物與14個樣品的DNA模板進行PCR擴增后，根據瓊脂糖凝膠電泳檢測結果篩選出特異性條帶.

6%聚丙烯凝膠電泳檢測：將每個樣品的PCR產物經95℃變性7 min后，4℃冷卻15 min后，用6%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，電泳條件：電壓1 500 V，電泳時間45 min.之后取出凝膠用去離子水漂洗10 s后放在10%冰醋酸中固定10 min，去離子水漂洗后在0.1% AgNO3溶液中染色10 min，再用去離子水漂洗后放置1%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液中，放置脫色搖床上至條帶清晰后再次漂洗，觀察結果.

1.4 數據統(tǒng)計與分析

本實驗取帶型清晰，按有或無記錄，電泳條帶有時記為“1”，否則記為“0”的原則，建立14個玉米品種的0-1指紋數據庫.每個SSR位點的多態(tài)性信息量(Polymorphism information content，PIC) 按公式PIC=1-∑fi2計算，其中fi為i位點的等位基因頻率[13].利用分析軟件Popgene 1.32對篩選出的SSR引物的多態(tài)性、多態(tài)性指數(polymorphism information content，PIC)[14]、Nei’s遺傳多樣性指數和Shannon’s 信息指數(Shannon’s information index，I)[15]進行分析.將生成的數字化條帶使用NTSYS 2.10e[16]軟件計算不同品種之間遺傳相似系數(GS,genetic similarity)，使用非加權配對平均法(UPGMA,unweighted pair-group method with arithmetic means)構建聚類圖.

2 結果與分析

2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳

通過將PCR擴增產物變性后用聚丙烯酰胺凝膠電泳，引物擴增片段大小在150～450 bp，根據引物條帶多態(tài)性和清晰度，篩選出18對SSR引物，如圖1引物Phi072k4的擴增條帶大小符合引物信息.

圖1 引物Phi072k4對14份玉米材料擴增的SSR帶型

2.2 引物的多態(tài)性分析

根據指紋圖譜，18對SSR引物共檢測到87個多態(tài)性片段，每對引物檢測出的特異性多態(tài)片段分別為2～9個，引物Phi065k9和umc1492y13最少，檢測到2個，bnlg161k8最多，檢測到9個，平均每對引物可檢測到4.8個多態(tài)性位點.由表2可以看出Nei’s遺傳多樣性指數變幅為0.133～0.463，平均為0.335，其中bnlg1940k7的遺傳多樣性指數最高，為0.463.Shannon 信息指數變化范圍為0.257～0.655，平均為0.504，且Shannon 信息指數平均值均在0.5以上.18對引物的PIC變化范圍為0.328～0.848，其中bnlg161k8的PIC最高為0.848，Phi065k9的PIC最低為0.328，平均為0.585.PIC與擴增的等位基因的數目和基因的頻率有關，它能反映出SSR對品種的區(qū)分度，PIC平均值與材料的遺傳基礎豐富水平呈正關系[17，18]，當PIC≥0.5時，材料遺傳基礎為高度多態(tài)性；0.25≤PIC<0.5時為中度多態(tài)性；PIC<0.25時為低度多態(tài)性.本研究中，18對引物PIC平均值高于0.5，說明14份玉米品種的遺傳基礎豐富，呈高度多態(tài)性.

表2 18對SSR核心引物的多態(tài)性評估

2.3 遺傳多樣性分析

利用NTSYS 2.10e軟件對14份玉米品種進行遺傳相似性分析，遺傳相似系數變幅為0.097～0.802，平均遺傳相似系數為0.439(表3).大白玉9號與銅玉593遺傳相似系數為0.802，其兩者之間遺傳相似性較高，遺傳基礎差異最小.而大白玉9號與西抗18的遺傳相似系數最小，為0.097，遺傳基礎差異最大.

表3 14份玉米的遺傳相似系數

2.4 聚類分析

基于遺傳相似系數應用UPGMA對14種玉米進行遺傳聚類分析.結果顯示(圖2)，以0.68為閥值可將14個品種分為五大類群，其中第Ⅰ類含2個品種，博玉19和昭黃11；第Ⅱ類含5個品種，羅單566、云大001、同玉213、大天44和大天183；第Ⅲ類有3個品種，金玉2號、大天006和同玉593；第Ⅳ類只含1個品種，貴單10號；第Ⅴ類包括3個品種，西抗18、大白玉9號和云優(yōu)19.

圖2 14個玉米品種的聚類分析

3 討 論

種質資源是培育作物優(yōu)質、高產的物質基礎，是維系國家食物安全的重要保證，而種質資源遺傳背景單一化會導致優(yōu)良遺傳資源的丟失.玉米種質資源的遺傳多樣性是進行玉米遺傳改良的基礎.SSR分子標記技術是近年發(fā)展較快和應用較廣的研究種質資源遺傳多樣性的生物技術.李麗華等[19]利用62對SSR引物研究了135個西南地區(qū)玉米自交系的遺傳多樣性，結果說明云南地區(qū)的玉米與四川地區(qū)的玉米之間有相對較大的遺傳多樣性，也表明地理來源差異相對較大的材料遺傳多樣性相對較豐富.姚啟倫等[20]利用SSR技術分別對來自云南和貴州的15個玉米地方品種群體進行遺傳多樣性分析，表明云南和貴州玉米地方品種存在較高的群體內遺傳變異，且云南較貴州玉米地方品種的遺傳變異程度更高.劉曉鑫[21]對中國玉米地方品種進行SSR標記檢測，分析地方品種的遺傳多樣性，結果表明骨干自交系和西南山地玉米區(qū)的大部分群體結果單一，說明中國農家品種血緣的本土化.劉海忠等[22]為了拓寬玉米自交系的遺傳基礎，加快歐美優(yōu)異種質的融入與利用，利用SSR分子標記對120份來自美國和塞爾維亞及2份中國的玉米自交系進行遺傳多樣性和聚類分析，結果表明美國NSS和塞爾維亞自交系群比美國SS和中國骨干系群遺傳多樣性高；美國NSS群與美國SS、塞爾維亞兩個群之間的遺傳一致度較高，表明美國與塞爾維亞自交系之間基因交流頻繁，親緣關系較近，為來自歐美自交系在玉米育種中合理利用提供可靠依據.昭通，位于云貴高原北部斜坡地帶，云貴川三省結合部，地理及氣候條件復雜.當地的玉米種質經過長期的自然選擇形成了遺傳多樣性較豐富的山地玉米種質資源.

因此，本研究利用農業(yè)行業(yè)標準NY/T1432-2014中篩選的18對SSR引物對云南省昭通種植的14種玉米品種進行遺傳多樣性分析，共檢測到87個多態(tài)性位點，平均每對引物可檢測到4.8個多態(tài)性位點，多態(tài)性指數(PIC)為0.512～0.812，平均值為0.686，低于姚啟倫等[20]云南的15個玉米地方品種的PIC值0.77，可能經過多年種植后，部分玉米種質資源本土化，遺傳基礎變窄，但呈高度多態(tài)性.遺傳相似系數變幅為0.417～0.819，平均遺傳相似系數為0.632，遺傳差異明顯，以0.65為閥值可將14個品種分為5大類群.根據不同的育種目標，以聚類分析結果為依據對地方玉米品種進行定向的改良和利用，可為昭通市玉米種質資源的選育和推廣提供理論和技術支持，為今后的玉米育種工作中引進不同類型品種和不斷提高云南省種質資源基礎的豐富度、品質提供科學依據.