萬瓊蓮，蘇 帆，許杏萍，蔡 紅，王連春

(1.玉溪師范學院 化學生物與環(huán)境學院，云南 玉溪 653100; 2.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，云南 昆明 650201)

植原體(phytoplasma)屬細菌界柔膜菌綱、植原體候選屬，是目前發(fā)現(xiàn)最小的細菌.植原體病害侵染常引起植物產(chǎn)生叢枝、矮化、黃化、花變綠、花變?nèi)~、巨芽、畸形等癥狀.該病害對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成嚴重損失，迄今世界各地報道的植原體病害已有1 000多種[1].植原體由于不能體外培養(yǎng)，因此常采用分子鑒定的方法進行檢測或進行基因克隆和測序[2～8].

本研究中所采集的樣品屬于榆科山黃麻屬(TremaLour.)植物，其形態(tài)與該屬中的羽脈山黃麻(TremalevigataHand-Mazz.)最為接近.山黃麻為喬木或灌木，葉互生，生長在熱帶和亞熱帶，在云南廣泛分布，具有生態(tài)價值，屬綠化先鋒物種[9,10].本研究針對植原體的保守基因(16S rRNA)采用分子生物學方法對云南省峨山縣采集到的表現(xiàn)為叢枝、小葉和黃化典型癥狀的感病植株進行檢測鑒定，以明確病原及其株系的分類地位，為該病害的深入研究和防治提供材料和基礎.

1 材料與方法

1.1 樣品的來源

樣品采自云南省玉溪市峨山縣表現(xiàn)為典型叢枝、小葉、黃化癥狀的山黃麻感病植株，海拔400 m.

1.2 總DNA的提取、PCR擴增、克隆及測序

參照“百泰克”新型快速植物基因組DNA(目錄號:DP3112)提取試劑盒方法提取植株總DNA，將提取的DNA置于-20℃下保存?zhèn)溆?針對16S rDNA采用植原體通用引物P1 /P7 和R16F2n /R16R2[11,12]進行巢式PCR 擴增(引物由云南農(nóng)業(yè)大學蔡紅教授提供).在紫外透射儀上切取大小正確的目的片段，用植物基因組DNA純化試劑盒(昆明碩陽)純化回收，與pMD19-T ( TaKaRa) 載體連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，采用PCR反應篩選出陽性克隆后送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序.PCR反應條件：每次反應前DNA稀釋25倍，直接PCR，94℃預處理5 min；94℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min.巢式PCR，95℃預處理5 min；95℃ 30 S，55℃ l min，72℃ l min 30 S，35個循環(huán)；72℃延伸10 min.

表1 植原體16S rDNA的通用引物

1.3 序列分析和進化樹的構(gòu)建

將測序所得序列錄入GenBank進行BLAST比對，確定是否為植原體.通過植原體在線分類鑒定工具iPhyClassifier(http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi)針對16S rDNA F2nR2片段進行相關(guān)候選種的確定，得出虛擬RFLP圖譜及相似系數(shù)(similarity coefficient，F(xiàn))，確定16Sr組/亞組.用MEGA軟件采用鄰接法(neighbor-joining method)進行植原體候選種和16Sr I組(Candidatus Phytoplasma asteris)不同亞組成員的進化樹構(gòu)建，以1 000為重復值進行Bootstrap校驗，用在線工具MUSCLE(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/#)進行多序列比對和組內(nèi)進化樹構(gòu)建，得出序列同源性，分析親緣關(guān)系的遠近.

2 結(jié)果與分析

2.1 感病植株的癥狀及16S rDNA片段PCR擴增結(jié)果

感病植株與健康植株相比癥狀明顯表現(xiàn)為叢枝、小葉和黃化，叢枝處枝條密集叢生，遠看呈“鳥窩狀”，同時伴有節(jié)間縮短，葉片卷曲變小.有些樹叢枝多而密集且整株枯死(圖1).其中，圖1-A:健康枝葉；圖1-B:健康和叢枝對照.從感病植株中提取總DNA進行直接PCR和巢式PCR擴增，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后獲得大小約1 200 kb 的16S rDNA 片段(圖2).

圖1 山黃麻叢枝病癥狀圖 圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 16S rDNA序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將擴增得到的約1 200 bp大小的特異性片段進行割膠純化、克隆和測序，結(jié)果表明16S rDNA 擴增片段含1 246個核苷酸，G + C 含量為47.11 % ，符合植原體基因組G + C含量特征(圖3).利用數(shù)據(jù)庫GenBank 的BLAST程序?qū)?6S rDNA進行同源檢索發(fā)現(xiàn)該序列為植原體，將此片段命名為山黃麻叢枝植原體(Tremawitches’-broom phytoplasma，SHMWB-ES).

圖3 山黃麻叢枝植原體16S rDNA片段(箭頭表示引物序列)

通過MUSCLE進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，山黃麻叢枝植原體(SHMWB-ES)與翠菊黃化植原體組(CandidatusPhytoplasma asteris，16Sr I組)部分成員同源性幾乎都在99%以上，其中與16Sr I-B亞組的菌株Bougainvillea proliferation(BSP-Br1，EU423898)和16Sr I-X亞組的Trema levigata witches’-broom(TLWBYN01，MN513329)同源性最高，分別為99.76%和99.84%，其次是和16Sr I-M亞組的Aster yellows (AVUT，AY265209)以及16Sr I-B亞組的Oenothera virescence(OAY，M30790)同源性達99.6%，與16Sr I-D亞組的Paulownia witches’-broom(PaWB，AY265206)是99.52%(表2).通過iPhyClassifier植原體在線分類鑒定工具分析表明該植原體與翠菊黃化植原體(CandidatusPhytoplasma asteris)相關(guān)，與該組參考株系(M30790)的序列相似性為99.6%，屬16S rI組成員，SHMWB-ES的F2nR2片段的17種限制性內(nèi)切酶的虛擬RFLP模型(圖3)與16Sr I-B亞組的參考模型(AP006628)最為相似，相似系數(shù)F為0.96，因此該植原體可能是16S rI組的一個新成員.

利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建山黃麻叢枝植原體(SHMWB-ES)和已被正式描述的31個候選種(Ca. Phytoplasma) 的16S rDNA系統(tǒng)進化樹(圖4)，SHMWB-ES與植原體16Sr I組成員明顯聚為一個的類群，表明該植原體屬于翠菊黃化植原體組(16Sr I組).山黃麻屬榆科植物，本研究所得結(jié)果與已報道的榆科榆屬相關(guān)植原體16Sr V-A亞組代表成員Ca.P.ulmi(EY1，AY197655)明顯不在一支.通過MUSCLE在線分析工具構(gòu)建SHMWB-ES與21個16S rI組內(nèi)成員的系統(tǒng)進化樹表明SHMWB-ES在16Sr I組成員中與16Sr I-B亞組的菌株BSP-Br1(EU423898)、16Sr I-X亞組的TLWBYN01(MN513329)、BG01(LT594117)、BG02(LT594118)菌株親緣關(guān)系更近.

圖5 SHMWB-ES與31個植原體候選種的16S rDNA系統(tǒng)進化樹

圖6 SHMWB-ES與21個16S rI組成員的 16S rDNA 系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論和討論

植原體侵染植株后可引起典型的叢枝癥狀，例如泡桐叢枝病[13]和棗瘋病[14]，其中翠菊黃化植原體組(CandidatusPhytoplasma asteris，16Sr I組)是植原體最大的組，在全世界范圍內(nèi)分布較為廣泛，組內(nèi)植原體變化也最大[15].本研究通過采集在云南省峨山縣發(fā)現(xiàn)的呈現(xiàn)典型叢枝癥狀山黃麻感病植株進行植原體分子檢測，以確定其病害的發(fā)生是否與植原體相關(guān).結(jié)果表明山黃麻叢枝中確實存在植原體，通過分類鑒定也進一步得出山黃麻叢枝植原體(Tremawitches’-broom phytoplasma，SHMWB-ES)屬于翠菊黃化植原體組(16Sr I組)成員，與16Sr I-B亞組和16Sr I-X亞組的親緣關(guān)系較近，雖然SHMWB-ES的F2nR2片段RFLP模型與16Sr I-B亞組的參考模型(AP006628)最為相似，但相似系數(shù)F僅為0.96，未達到0.97以上[16]，因此本研究中山黃麻叢枝植原體可能是16Sr I組中的新成員，對于在該組中的亞組地位還有待進一步分析.目前，植原體的分類主要基于16S rRNA 基因序列，有的結(jié)合核糖體蛋白基因(rp) 、分泌蛋白基因(SecY) 及延伸因子(tuf) 等進行分析.為了更客觀的對山黃麻叢枝植原體進行分類鑒定，下一步可采用多位點序列分析法(Multilocus Sequence Analysis)[17]對該植原體的多個保守基因進行聯(lián)合分析.

本研究中的山黃麻為榆科山黃麻屬植物，其形態(tài)特征與該屬中羽脈山黃麻最為接近，但在調(diào)查期間，該植株還未開花結(jié)果，因此對于該植原體寄主的種類還需進一步確認.已報道的榆科榆樹黃化植原體為16Sr V-A亞組[18,19]，有關(guān)榆科山黃麻屬植物植原體病害的報道較少，目前只有在云南省新平縣發(fā)現(xiàn)的羽脈山黃麻植原體(MN513329)，且本研究中的植原體與上述植原體并不一樣，但是存在較高的同源性，說明植原體在山黃麻屬植物中是有變異的，但他們又同屬于16Sr I組，山黃麻在云南分布較多，這一發(fā)現(xiàn)說明還有很多地區(qū)的山黃麻可能存在植原體，這需要進一步的調(diào)查和研究.此外，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有幾棵叢枝癥狀比較嚴重的山黃麻已經(jīng)枯死，說明發(fā)病嚴重有可能會導致植株的死亡，因此對山黃麻叢枝病應引起足夠重視，并采取措施進行防治.