王禮賢，胡月陽，李 琰，楊 漪，康 山

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)到子宮內(nèi)腔以外位置[1]，異位組織中子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells，ESC)圍繞、內(nèi)膜腺體生長(zhǎng)，ESC、內(nèi)膜腺體類似腫瘤特征可向周圍器官轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致多種并發(fā)癥產(chǎn)生[2]。EMs發(fā)病率在育齡期婦女中高達(dá)10%～15%，且有不斷上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量和身心健康。微小RNA(microRNA，miRNA)是一段短鏈非編碼RNA，表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，已經(jīng)證明可參與子宮肌瘤[3]、卵巢癌[4]、宮腔黏連[5]等婦科疾病免疫逃逸及微環(huán)境形成等過程。為探究miRNA與EMs的關(guān)系，該研究對(duì)兩組外泌體miRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，分析其差異表達(dá)，為下一步miRNA靶基因預(yù)測(cè)信號(hào)通路富集分析做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 一般資料2017年1月～2018年12月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院確診為EMs患者為研究對(duì)象，40例，年齡24～37(30.58±4.18)歲，病灶分布特點(diǎn)：腹膜型9例，卵巢型21例，深部型10例；根據(jù)美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)EMs分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期6例，Ⅱ期12例，Ⅲ期14例，Ⅳ期8例；另選取同一時(shí)期腹腔鏡檢查子宮內(nèi)膜正常子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅲ子宮手術(shù)(其中23例宮頸病變表面破壞術(shù)、17例宮頸局部切除術(shù)，月經(jīng)結(jié)束3～7 d手術(shù))患者為對(duì)照組，40例，年齡24～38(30.51±3.69)歲，兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。EMs診斷標(biāo)準(zhǔn)：腹腔鏡手術(shù)確診[6]。EMs患者納入標(biāo)準(zhǔn)：① 均已確診為EMs患者；② 月經(jīng)規(guī)律的育齡期婦女；③ 年齡>20歲；④ 本研究患者知情同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并通過。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 子宮內(nèi)膜病變接受激素治療患者；② 急性全身感染性疾病患者；③ 懷孕期及哺乳期婦女；④ 多種藥物過敏者；⑤因精神或其他疾病情況無法參加該項(xiàng)研究者。

1.2 試劑與器材磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(美國(guó)HyClone公司)；10%胎牛血清、DMEM(美國(guó)Gibco公司)；I型膠原酶(美國(guó)ATCC公司)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；3%雙氧水(江山市雙氧水有限公司)；醋酸雙氧鈾(青島捷世康生物科技有限公司)；波形蛋白單抗、角蛋白單抗(上海碧云天公司)；Total Exosome Isolation試劑盒、RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)； cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)；2×Hi SYBR Green QPCR Mix(北京百奧萊博科技有限公司)。光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Spectra S/TEM 掃描透射電子顯微鏡[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；Agilent 2200 TapeStation(中國(guó)安捷倫科技有限公司)；Illumina HiSeqTM 2500測(cè)序儀(南京迪康金諾生物技術(shù)有限公司)；qRT-PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3 樣本采集鈍器刮取EMs患者異位內(nèi)膜組織、CIN Ⅲ患者正常內(nèi)膜組織，放入預(yù)冷的裝有無菌的廣口瓶中清洗3次，浸泡在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，立即送回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.4 ESC外泌體收集

1.4.1ESC原代培養(yǎng)與純度鑒定 ESC原代培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[7]中方法并改進(jìn)進(jìn)行。眼科剪剪碎上述組織，加入無血清DMEM培養(yǎng)基反復(fù)吹打后移至離心管中，加400 μl 0.25% Ⅰ型膠原酶消化，組織呈絮狀即可終止消化，消化時(shí)間80～160 min，用400目過濾，過濾液放入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)，常規(guī)換液培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞24 h開始貼壁，72 h細(xì)胞貼壁完成。4%多聚甲醛固定、3%雙氧水封閉細(xì)胞，分別加入波形蛋白單抗、角蛋白單抗孵育；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，二抗孵育后滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液封片，光學(xué)顯微鏡觀察。培養(yǎng)結(jié)果：研究組收集成功37例，對(duì)照組收集成功36例。鑒定成功細(xì)胞置于新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)5 d拍照。

1.4.2ESC外泌體的分離與鑒定 ESC外泌體分離與鑒定參考文獻(xiàn)[8]，Total Exosome Isolation試劑盒法提取ESC外泌體，具體步驟：收集ESC后2 000 r/min離心30 min，轉(zhuǎn)移上層清液至新離心管中，加1/2樣本量的試劑，混勻后4 ℃過夜，10 000 r/min離心1 h后棄上清，50 μl PBS重懸沉淀后至-80 ℃保存。醋酸雙氧鈾負(fù)染透射電鏡觀察外泌體形態(tài)并鑒定。

1.5 ESC外泌體miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期EMs患者外泌體中隨機(jī)選出3期，再每期中隨機(jī)選1例為代表；對(duì)照組則采用隨機(jī)數(shù)字法抽3例進(jìn)行芯片表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)。Agilent 2200 TapeStation進(jìn)行RNA建庫，Illumina HiSeqTM 2500測(cè)序儀對(duì)質(zhì)檢文庫運(yùn)進(jìn)行測(cè)序，分析兩組外泌體miRNA差異性。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)ESC外泌體miR-205、miR-542-3p水平取-80 ℃冰箱兩組ESC外泌體，RNA提取試劑盒提取總RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，qRT-PCR儀對(duì)miR-205、miR-542-3p、U6擴(kuò)增。miR-205-F：5′-CACGTCCCAGGCTCCA-3′,miR-205-R：5′-CGGGCATCGAAACTGCCAAT-3′；miR- 542-3p-F：5′-TGTGACAGATTGATAACT-3′，miR-542-3p-R：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC GCACTGGATACGACCTGCGGTTTCAGT-3′；U6-F：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，U6-R：5′-GG AACGCTTCACGAATTTG-3′。上樣體系：cDNA 1 μl(50 ng/μl)，F(xiàn)/R(10 μmol/L)各0.5 μl，2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μl，ddH2O 8.0 μl。反應(yīng)條件：95 ℃、90 s；95 ℃、30 s；60 ℃、55 s；45個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法對(duì)miR-205、miR-542-3p表達(dá)水平定量分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組ESC比較研究組細(xì)胞平鋪貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，邊緣清晰，形狀規(guī)則。對(duì)照組細(xì)胞雖平鋪貼壁生長(zhǎng)，部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，亦有細(xì)胞呈三角形或多角形，邊緣輪廓不清晰，形狀相對(duì)研究組不規(guī)則。見圖1。

圖1 兩組ESC培養(yǎng)過程中代表性相襯圖像 ×100A：研究組；B：對(duì)照組

2.2 兩組細(xì)胞外泌體鑒定ESC外泌體直徑在30～150 nm之間，球形，囊泡狀結(jié)構(gòu)。兩組ESC外泌體結(jié)構(gòu)類似。見圖2。

圖2 醋酸雙氧鈾負(fù)染后ESC外泌體透射電鏡下形態(tài) ×200

2.3 兩組ESC外泌體差異miRNA篩選研究組與對(duì)照組ESC外泌體有39種miRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，研究組上調(diào)miRNA 14個(gè)，下調(diào)25個(gè)，部分差異表達(dá)的miRNA見表1。雙聚類分析圖顯示關(guān)系相近的miRNA聚在一起。見圖3。

表1 研究組差異表達(dá)的miRNA

圖3 兩組ESC外泌體中差異miRNA雙聚類分析

2.4 兩組ESC外泌體中qRT-PCR檢測(cè)miR-205、miR-542-3p表達(dá)量與對(duì)照組比較，研究組ESC外泌體miR-205表達(dá)量升高，miR-542-3p表達(dá)量降低(P<0.05)。見表2。

表2 兩組ESC外泌體qRT-PCR檢測(cè)miR-205、miR-542-3p水平

2.5 miRNA芯片檢測(cè)與qRT-PCR檢測(cè)ESC外泌體差異倍數(shù)比較miRNA芯片檢測(cè)與qRT-PCR檢測(cè)ESC外泌體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.6 靶基因預(yù)測(cè)microTv3.0、Targestscan、PicTar 3種靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)ESC外泌體上調(diào)倍數(shù)最高的7個(gè)、下調(diào)倍數(shù)最高的8個(gè)miRNA與EMs有關(guān)預(yù)測(cè)的靶基因，2種或2種以上預(yù)測(cè)網(wǎng)站中出現(xiàn)靶基因。見表4。

表3 miRNA芯片檢測(cè)與qRT-PCR檢測(cè)ESC外泌體比較

表4 EMs中差異靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)

3 討論

EMs屬良性疾病，但有侵襲、種植、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，被稱為“良性癌癥”。臨床并發(fā)癥主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛、月經(jīng)紊亂和不孕等[9]。需長(zhǎng)期使用藥物治療，副作用大、效果不理想，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高[10]，嚴(yán)重影響患者身心健康。因此尋找早期生物學(xué)標(biāo)志物可提早預(yù)防疾病。外泌體是由細(xì)胞向細(xì)胞外間隙處釋放的脂質(zhì)雙分子層小囊泡，內(nèi)含多種RNA，其中成熟的miRNA含量最高，約占41.72%[11]。腫瘤細(xì)胞源外泌體miRNA參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸以及微環(huán)境的形成等過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

以往研究[12]中已發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA影響疾病發(fā)生進(jìn)程。外泌體miR-210是腎癌的標(biāo)志物，在腎癌組織中高表達(dá)，影響腎癌疾病進(jìn)程；外泌體miRNA在胃癌中可影響胃癌的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)、腫瘤耐受等，且穩(wěn)定性較好[13]。有臨床研究[14-15]顯示，EMs患者外泌體中miR-21較非EMs患者明顯增加，對(duì)血管生成具有重要作用，與EMs發(fā)生發(fā)展存在一定聯(lián)系。亦有研究[16]報(bào)道，miR-183在細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)下調(diào)可抑制凋亡，增強(qiáng)侵襲能力。本研究以EMs患者異位內(nèi)膜ESC外泌體為研究對(duì)象、CIN Ⅲ患者正常內(nèi)膜組織ESC外泌體為對(duì)照組，體外離體培養(yǎng)兩組ESC發(fā)現(xiàn)外觀相似，細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)、呈長(zhǎng)梭形，少部分呈星形，提示ESC分離成功，電鏡下觀察兩組ESC外泌體直徑均在30～150 nm之間，球形，囊泡狀結(jié)構(gòu)，且純度較高。miRNA芯片檢測(cè)人類847種miRNA發(fā)現(xiàn)在兩組ESC外泌體中39種miRNA表達(dá)有差異；與對(duì)照組比較，研究組上調(diào)14個(gè)，下調(diào)25個(gè)，與梁靜 等[17]子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中microRNA差異表達(dá)譜部分miRNA相同，卻不完全一致。本研究中研究組miR-205相對(duì)表達(dá)量升高最多，miR-542-3p相對(duì)表達(dá)量降低最多，qRT-PCR驗(yàn)證ESC外泌體miR-205、miR-542-3p表達(dá)倍數(shù)與芯片檢測(cè)結(jié)果類似，提示miR-205、miR-542-3p與EMs關(guān)系密切，提示外泌體可作為非侵入性診斷EMs有效生物標(biāo)志物，其功能與特性為臨床靶向治療提供新方向。

miR-205表達(dá)升高在食管癌中可加快細(xì)胞侵潤(rùn)遷移、在乳腺癌中可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)[18]。miR-542-3p在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮抑癌作用，表達(dá)量降低可加速結(jié)腸癌、星型細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-205、miR-200a、miR-200b、miR-542-3p、miR-9都可調(diào)控PTEN基因，PTEN是第一個(gè)迄今為止發(fā)現(xiàn)有雙特異性磷酸活性的腫瘤抑制基因，在EMs中可判斷預(yù)后[20]；提示這些miRNA可能通過調(diào)控PTEN進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生。miR-205、miR-200a、miR-200b都位于1號(hào)染色體且表達(dá)上調(diào)，提示EMs患者可能在1號(hào)染色體上發(fā)生基因重組，影響EMs表達(dá)差異。miR-542-3p、miR-9在EMs中表達(dá)下調(diào)，與陳觀盛等[21]的研究結(jié)果一致，提示可能以原癌基因?yàn)榘悬c(diǎn)，表達(dá)下降可促進(jìn)原癌基因表達(dá)，影響EMs發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，但關(guān)于EMs病因有待進(jìn)一步探究，故外泌體在EMs中的作用機(jī)制仍待闡明。

本研究借助芯片數(shù)據(jù)，挖掘與EMs有重要影響的ESC外泌體miRNA，并對(duì)其差異miRNA分析，初步驗(yàn)證ESC外泌體中上調(diào)倍數(shù)最多的7個(gè)、下調(diào)倍數(shù)最多的8個(gè)與EMs有關(guān)的靶基因，對(duì)EMs患者ESC外泌體中miRNA表達(dá)水平有了進(jìn)一步了解，為分子靶向治療、探討相關(guān)疾病提供分子理論基礎(chǔ)。