王 悅，劉宇峰，郭 輝，劉曉梅，伍麗萍，施秉銀

Graves眼病 (thyroid associated ophthalmopathy, TAO)是一種常見的自身免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病，常見臨床表現(xiàn)有眼球突出、水腫、疼痛、活動(dòng)障礙等[1]。TAO現(xiàn)有治療主要針對(duì)中重度活動(dòng)期患者，給予大劑量注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉靜脈沖擊抑制免疫及炎癥反應(yīng)，然而20%～30%的TAO患者對(duì)注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉沖擊治療無反應(yīng)，10%～20%的患者在治療結(jié)束后復(fù)發(fā)[2]。激素具有廣泛的免疫及炎癥抑制作用，可減少淋巴細(xì)胞趨化作用，減輕受累組織炎癥反應(yīng)[3-4]。該研究主要聚焦于TAO患者注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉沖擊前后T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)的變化，進(jìn)一步探索激素沖擊治療TAO的免疫學(xué)機(jī)制，為新興免疫學(xué)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診就診的6例TAO患者，編號(hào)為L(zhǎng)W003、LW004、LW005、LW006、LW008、LW009。于診斷時(shí)(T1)、第1次沖擊治療結(jié)束時(shí)(T2)、第3次沖擊治療結(jié)束時(shí)(T3)的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集外周血。提取外周血單個(gè)核細(xì)胞并提取RNA進(jìn)行TCR免疫組庫(kù)測(cè)序，然后進(jìn)行后續(xù)高通量數(shù)據(jù)挖掘分析。TAO患者均接受注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉靜脈沖擊治療，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉0.5 g/次，隔天1次，共3次為1個(gè)療程，每個(gè)療程間隔21 d，共3個(gè)療程。TAO的診斷依據(jù)是臨床表現(xiàn)、甲狀腺激素、促甲狀腺素受體抗體、甲狀腺B超及眼眶CT。排除標(biāo)準(zhǔn)包括合并其他自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤、1年內(nèi)使用過其他免疫抑制劑。

1.2 TCR測(cè)序于診斷時(shí)、第1次沖擊治療結(jié)束時(shí)和第3次沖擊治療結(jié)束時(shí)的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集空腹外周血10 ml。取新鮮抗凝血10 ml與等體積PBS液混勻，使用人淋巴細(xì)胞分離液提取單個(gè)核細(xì)胞，待樣品收齊后統(tǒng)一提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。cDNA加入TCR VJ引物后，進(jìn)行多重PCR(QIAGEN multiplex PCR Kit)?；厥?、純化后(QIAquick PCR Purification Kit)，進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)，并純化，經(jīng)過末端修復(fù)后的DNA片段在其3'端連上“A”堿基；接下進(jìn)行接頭連接(Adapter oligo mix和DNA ligase)。PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行電泳、膠純化回收(QIAquick PCR Purification Kit)，溶于Elution Buffer中，文庫(kù)構(gòu)建完成。采用HiSeq 2000測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)T淋巴細(xì)胞共刺激分子及T淋巴細(xì)胞亞群(Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞)進(jìn)行mRNA水平上檢測(cè)(CD28、CD40、CTLA-4、PD1、TBX21、ATA-3、RORC和FOXP3基因)。提前根據(jù)各基因序列設(shè)計(jì)并合成引物，應(yīng)用CFX96 Real-Time PCR 檢測(cè)儀 (Bio-Rad) and SYBR Premix Taq (Takara)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定。PCR條件為：首次循環(huán)變性95 ℃、30 s，接著變性95 ℃、5 s，復(fù)性60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。用一個(gè)cDNA倍比稀釋樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。

2 結(jié)果

2.1 TAO激素沖擊治療前后TCR多樣性變化使用Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來表示TCR免疫組庫(kù)的多樣性。TAO患者在診斷時(shí)(T1)、第1次沖擊治療結(jié)束后(T2)和第3次沖擊治療結(jié)束后(T3)的多樣性指數(shù)進(jìn)行組間兩兩差異分析，t檢驗(yàn)結(jié)果(Simpson指數(shù)：P=0.67,P=0.84,P=0.56；Shannon指數(shù)：P=0.32,P=0.85,P=0.35)表明各組件差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。

2.2 TAO激素沖擊治療前后TCR高頻VJ遷移在正常情況下，每個(gè)特定VJ家族構(gòu)成的克隆群體占全部克隆的比例與該亞家族中氨基酸種類數(shù)目成正比。當(dāng)疾病發(fā)生時(shí)，針對(duì)抗原的高親和力克隆(致病克隆)會(huì)有更高的擴(kuò)增速率，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于整個(gè)家族擴(kuò)增速率，即偏離正常的擴(kuò)增斜率，向X軸傾斜(圖2A)。對(duì)TAO患者而言，淺藍(lán)、藍(lán)和黃色的實(shí)心圓分別代表診斷時(shí)、第1次沖擊治療結(jié)束后和第3次沖擊治療結(jié)束后的TCR免疫組庫(kù)。用灰色的實(shí)心圓掩蓋住了低頻VJ家族，圖2A代表TAO患者高頻TCR的克隆遷移。橫坐標(biāo)表示VJ家族的頻率，縱坐標(biāo)表示VJ家族中氨基酸種類的數(shù)目。坐標(biāo)軸右下方代表的是頻率高，同時(shí)氨基酸種類少的VJ家族，提示該VJ家族最有可能是致病的家族。分析這部分VJ家族動(dòng)態(tài)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多次的檢測(cè)中這些家族始終存在，在各自當(dāng)前狀態(tài)下其頻率還是占優(yōu)勢(shì)(圖2B)。

圖1 TAO患者TCR多樣性指數(shù)變化情況

圖2 TAO激素沖擊治療前后TCR高頻VJ家族遷移

2.3 TAO激素沖擊治療前后TCR VJ家族頻率變化對(duì)這些患者隨訪結(jié)果顯示LW004和LW009沖擊3次后治療效果不理想，患者眼部癥狀無明顯改善，甚至有加重的趨勢(shì)。而剩下4例在3次治療結(jié)束后，突眼明顯改善，炎癥減輕。計(jì)算出這些患者TCR組庫(kù)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的頻率，按照頻率從大到小排列，并制作出時(shí)間折線。隨著治療的進(jìn)展，LW004和LW009高頻VJ家族，其頻率反而增加(圖3A)，而治療效果理想的4例患者，其高頻VJ家族沒有明顯的頻率變化(圖3B)。因此，我們推測(cè)致病的T淋巴細(xì)胞克隆隨著病程的變化不會(huì)發(fā)生消除，而是穩(wěn)定的存在。同時(shí)，疾病的復(fù)發(fā)與這些T淋巴細(xì)胞克隆的擴(kuò)增具有相關(guān)性。

圖3 TAO激素沖擊治療前后TCR VJ家族頻率變化A:治療效果不佳組；B:治療效果理想組

2.4 TAO激素沖擊治療前后TCR VJ家族中克隆變化將治療效果不佳的LW004和治療效果理想的LW003單獨(dú)挑出，繪制其高頻的兩個(gè)VJ家族V9-J1-6/V2-J1-4和V9-J1-6/V19-J1-3。圖4A可清晰的展示出V9-J1-6和V2-J1-4兩個(gè)家族中有兩個(gè)克隆，其頻率分別由24.06%和6.67%擴(kuò)增至40.9%和15.76%。這兩個(gè)克隆的累積頻率已經(jīng)大于該個(gè)體所有TCR組庫(kù)的50%。從圖4B可以看出，V9-J1-6和V19-J1-3兩個(gè)家族中的克隆始終穩(wěn)定存在，并未消失。該結(jié)果可進(jìn)一步說明致病的T淋巴細(xì)胞克隆隨著病程的變化穩(wěn)定的存在。而疾病的復(fù)發(fā)與這些T淋巴細(xì)胞克隆的擴(kuò)增高度相關(guān)。

圖4 TAO激素沖擊治療前后TCR VJ家族中克隆變化A: LW004治療效果不佳；B:LW003 治療效果理想

2.5 TAO激素沖擊治療前后T細(xì)胞亞群變化CD28和CD40是T細(xì)胞表面表達(dá)的刺激性共刺激分子，CTLA-4和PD-1是抑制性共刺激分子。TAO患者的這四種共刺激分子隨著病程變化組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。當(dāng)T淋巴細(xì)胞接受雙信號(hào)發(fā)生活化、增殖后，緊接著在細(xì)胞因子等影響下向不同的T亞群進(jìn)行分化，這些亞群發(fā)揮完全不同的作用。Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，Th17細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，抑制其他效應(yīng)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。分別對(duì)Th1、Th2、Th17和Treg亞群的轉(zhuǎn)錄因子TBX21、GATA-3、RORC和FOXP3進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明TAO患者隨著病情的緩解，其RORC水平降低(P=0.039)(圖5)。該結(jié)果說明TAO患者病情緩解與Th17細(xì)胞減少有關(guān)。

圖5 TAO激素沖擊治療前后T細(xì)胞亞群變化與T1組比較：*P<0.05

3 討論

TAO激素治療后癥狀的緩解應(yīng)該伴隨著免疫系統(tǒng)重新進(jìn)入一種免疫耐受的狀態(tài)。但是到目前為止，緩解后的免疫基礎(chǔ)尚未完全闡明。有報(bào)道認(rèn)為緩解伴隨著主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)分子降低、黏附分子或共刺激分子的改變[5-6]。有研究[7]表明已緩解的Graves病患者外周血中還存在針對(duì)TSHR的自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，該研究結(jié)果被一種理論支持，該理論認(rèn)為抗原特異性T淋巴細(xì)胞在失去特異性抗原刺激后，還可以保持若干年不改變[7]。近期又有兩項(xiàng)研究[8-9]，多發(fā)性硬化患者和強(qiáng)直性脊柱炎患者接受造血干細(xì)胞移植后對(duì)免疫狀態(tài)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，盡管經(jīng)歷了大劑量化療和造血干細(xì)胞移植，患者體內(nèi)依然存在大量致病性T淋巴細(xì)胞克隆。這也許說明自身免疫性疾病的緩解是通過免疫平衡的重新建立，而不是消除反應(yīng)性克隆。本研究結(jié)果顯示TAO患者發(fā)病和緩解兩個(gè)階段TCR免疫組庫(kù)，無論從多樣性、克隆遷移還是克隆擴(kuò)增和分布都沒有變化。因此，致病的T淋巴細(xì)胞克隆隨著病程的變化不會(huì)發(fā)生消除，而是穩(wěn)定的存在。并且疾病的復(fù)發(fā)與這些T淋巴細(xì)胞克隆的擴(kuò)增高度相關(guān)。

T淋巴細(xì)胞活化除了需要TCR/pMHC第一信號(hào)外，還需要共刺激分子傳遞的第二信號(hào)。當(dāng)T淋巴細(xì)胞激活后進(jìn)一步增殖、分化為不同的亞家族，發(fā)揮不同的作用[10-11]。為了進(jìn)一步探索免疫恢復(fù)的機(jī)制，本研究對(duì)T細(xì)胞共刺激分子和T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明盡管TAO患者TCR免疫組庫(kù)總體上在病程中沒有變化，但是Th17細(xì)胞下降。該結(jié)果再一次證實(shí)自身免疫性疾病緩解后的免疫耐受狀態(tài)是由免疫平衡的重新建立導(dǎo)致的，自身反應(yīng)性克隆并沒有消除，這也很可能是自身免疫性疾病容易復(fù)發(fā)的原因之一。因此，在未來免疫治療的研發(fā)中應(yīng)當(dāng)考慮針對(duì)致病T淋巴細(xì)胞的靶向免疫抑制。