向 輝，唐 明，李 陽，林怡秀，鄭 勇，陳衛(wèi)剛

食管癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，90%的病例為食管鱗狀細(xì)胞癌[1]。食管癌的發(fā)病有著明顯的地域分布特征，其中位于新疆北部的哈薩克自治州新源縣和托里縣食管癌的發(fā)病率為90/100 000和155.9/100 000，遠(yuǎn)高于全國平均水平(14.95/100 000)和新疆漢族人群(13/100 000)[2]。食管癌早期癥狀不典型，侵襲和轉(zhuǎn)移前多無癥狀，5年生存率低于20%[3]，目前食管癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確。microRNAs(miRNAs)是一類大小約為23個(gè)核苷酸的非編碼RNA，有研究表明miRNAs的異常表達(dá)在食管鱗癌中發(fā)揮重要作用，如miR-21[4]、miR-375[5]、miR-34a[6]等。課題組前期[7]運(yùn)用miRNA基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織比較，miR-664b-5p在哈薩克族食管鱗癌組織中高表達(dá)，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片一致。目前尚不清楚miR-664b-5p在食管鱗癌中發(fā)揮的功能。該研究在食管鱗癌細(xì)胞EC9706和TE-1中過表達(dá)和下調(diào)miR-664b-5p，觀察食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲生物學(xué)行為的變化。

1 材料與方法

1.1 材料人食管鱗癌細(xì)胞株EC9706和TE-1由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方與民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室留存；胎牛血清購于以色列BI公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；miR-664b-5p模擬物和抑制劑及相應(yīng)的陰性對(duì)照均購于廣州銳博公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司；RNA抽提試劑Trizol試劑購于美國賽默飛公司，miR-664b-5p和內(nèi)參U6引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA qRT-PCR試劑盒購于德國QIAGEN公司，細(xì)胞增殖檢測CCK-8試劑盒購于日本東仁公司；兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax抗體購于英國Abcam公司；小鼠抗人β-actin抗體、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗購于北京中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染用含有10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，接種(3.0～5.0)×105個(gè)細(xì)胞/孔至6孔板，加入含10%胎牛血清不含抗生素的DMEM新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度融合至50%～70%時(shí)，應(yīng)用Lipofectamine 2000按照試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為4組：轉(zhuǎn)染miR-664b-5p mimic組(miR-664b-5p模擬物)、miR-664b-5p mimic NC組(miR-664b-5p模擬物陰性對(duì)照)、miR-664b-5p inhibitor組(miR-664b-5p抑制劑)、miR-664b-5p inhibitor NC組(miR-664b-5p抑制劑陰性對(duì)照)。轉(zhuǎn)染12 h后更換為含有10%胎牛血清完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 RNA的提取及qRT-PCR按照上述分組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，參照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后qRT-PCR檢測miR-664b-5p的表達(dá)，以U6為內(nèi)參。利用2-△△Ct方法計(jì)算miR-664b-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞(3 000個(gè)/孔)接種于96孔板，每孔體積100 μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72、96 h時(shí)在每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)孵育2 h后用酶標(biāo)儀測量各孔450 nm處的OD值。以時(shí)間點(diǎn)為橫軸，OD值為縱軸，繪制各組細(xì)胞生長曲線。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，按600個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，培養(yǎng)14 d。當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min。計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.6 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2×105/ml。在下室加入800 μl含20%血清的培養(yǎng)基，上室加入150 μl細(xì)胞懸液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用鑷子小心取出小室，吸干上室液體，4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色，用棉簽小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，用小刀切下小室底部膜，移至載玻片上中性樹膠封片，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野記錄穿過膜的細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)用無血清培養(yǎng)基按1 ∶7稀釋的基質(zhì)膠，取70 μl鋪在上層小室，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育4 h，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 Western blot用含有苯甲磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，100 ℃變性5 min，10%分離膠進(jìn)行蛋白電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜后加入二抗(1 ∶10 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，洗膜后加入發(fā)光液后曝光。采用Image J軟件分析測定蛋白條帶的灰度值，同時(shí)檢測β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參，計(jì)算Bax和Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-664b-5p的表達(dá)在食管癌細(xì)胞系EC9706和TE-1中分別轉(zhuǎn)染miR-664b-5p mimic、miR-664b-5p mimic NC或miR-664b-5p inhibitor、miR-664b-5p inhibitor NC，qRT-PCR檢測EC9706和TE-1細(xì)胞中各組miR-664b-5p的表達(dá)。結(jié)果顯示，EC9706和TE-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-664b-5p mimic組miR-664b-5p的表達(dá)水平高于miR-664b-5p mimic NC組(t=9.782，P=0.001；t=9.925，P=0.001)(圖1A)，而與miR-664b-5p inhibitor NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-664b-5p inhibitor組miR-664b-5p的表達(dá)減少(t=9.212，P=0.001；t=9.212，P=0.001) (圖1B)。

圖1 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后食管癌細(xì)胞中miR-664b-5p的表達(dá)

2.2 miR-664b-5p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果分析顯示，各組OD值見表1。EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后miR-664b-5p mimic組OD值開始低于陰性對(duì)照miR-664b-5p mimic NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.626，P=0.004)，96 h后miR-664b-5p mimic組增殖明顯抑制(t=14.086，P<0.001)(圖2A)。在TE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后miR-664b-5p mimic組OD值低于陰性對(duì)照miR-664b-5p mimic NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.991，P=0.024)(圖2B)。相反，EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-664b-5p inhibitor組24 h后OD值高于陰性對(duì)照miR-664b-5p inhibitor NC組 (t=12.486，P<0.001)(圖2C)。TE-1細(xì)胞miR-664b-5p inhibitor組同樣在24 h后OD值開始高于陰性對(duì)照miR-664b-5p inhibitor NC組(t=8.239，P<0.001)(圖2D)。

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-664b-5p后EC9706細(xì)胞miR-664b-5p mimic組克隆形成數(shù)(136.330±7.767)個(gè)低于對(duì)照組miR-664b-5p mimic NC組(293.330±20.207)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.561，P<0.001)。TE-1細(xì)胞miR-664b-5p mimic組克隆形成數(shù)(253.670±15.275)個(gè)明顯低于對(duì)照組miR-664b-5p mimic NC組(568.000±13.115)個(gè)(t=27.042，P<0.001) (圖3A)。而抑制miR-664b-5p表達(dá)后EC9706細(xì)胞miR-664b-5p inhibitor組克隆形成數(shù)(279.000±25.942)個(gè)高于對(duì)照組miR-664b-5p inhibitor NC組(154.000±11.533)個(gè)(t=7.626，P=0.002)。TE-1細(xì)胞miR-664b-5p inhibitor組克隆形成數(shù)(460.670±18.339)個(gè)高于對(duì)照組miR-664b-5p inhibitor NC組(344.000±11.533)個(gè)(t=9.328，P=0.001)(圖3B)。

表1 miR-664b-5p對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706和TE-1增殖的影響

圖2 CCK-8檢測miR-664b-5p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響

圖3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-664b-5p對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成的影響

2.3 miR-664b-5p對(duì)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， EC9706和TE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-664b-5p mimic組穿過小室底部膜的細(xì)胞數(shù)分別為 (81.000±15.716)和(126.333±18.339)個(gè)，少于相對(duì)應(yīng)miR-664b-5p mimic NC組細(xì)胞數(shù)(187.667±37.873)和(298.333±41.633)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.506，P=0.011；t=6.548，P=0.003) (圖4A)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中EC9706和TE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-664b-5p mimic組穿過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為(153.333±48.232)和(229.000±17.692)個(gè)，少于相對(duì)應(yīng)miR-664b-5p mimic NC組細(xì)胞數(shù)(297.000±24.062)和(540.333±69.644)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.617，P=0.010；t=7.504，P=0.002) (圖4B)，miR-664b-5p mimic NC組顯示出更高的遷移和侵襲能力。相反，抑制miR-664b-5p的表達(dá)后EC9706和TE-1細(xì)胞miR-664b-5p inhibitor組穿過小室底部膜遷移細(xì)胞數(shù)分別為(108.333±5.132)和(1 059.667±56.190)個(gè)，多于miR-664b-5p inhibitor NC組細(xì)胞數(shù)(64.000±12.288)和(100.667±8.082)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.766，P=0.004；t=29.260，P<0.001) (圖4C)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中EC9706和TE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-664b-5p inhibitor組穿過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為(220.000±23.065)和(760.333±40.278)個(gè)，多于相對(duì)應(yīng)miR-664b-5p inhibitor NC組細(xì)胞數(shù)(101.667±18.930)和(448.000±41.905)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.869，P=0.002；t=9.307，P<0.001) (圖4D)，miR-664b-5p inhibitor組顯示出更高的遷移和侵襲能力。

2.4 miR-664b-5p對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的影響Western blot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-664b-5p mimic 48 h后促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-664b-5p mimic NC組比較，EC9706和TE-1細(xì)胞中miR-664b-5p mimic組促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加(t=7.748，P=0.016；t=15.119，P=0.004)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)減少(t=27.520，P<0.001；t=21.066，P=0.002)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A、B)。而EC9706和TE-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-664b-5p inhibitor組與miR-664b-5p inhibitor NC組比較，促凋亡蛋白Bax表達(dá)減少(t=17.097，P<0.001；t=5.108，P=0.028)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)增加(t=19.400，P<0.001；t=15.633，P<0.001) (圖5C、D)。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-664b-5p對(duì)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 結(jié)晶紫染色×100

圖5 Western Blot檢測miR-664b-5p對(duì)食管癌細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)的影響

3 討論

miRNAs的異常表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為[8]。因此，全面地了解食管鱗癌相關(guān)的miRNAs，對(duì)疾病的預(yù)防、診斷和治療都十分重要。miR-664b-5p位于X染色體，包含24個(gè)核苷酸，由miRNA前體has-mir-664b的5’端臂加工而成。李彥樺 等[9]同樣運(yùn)用miRNA芯片在3例漢族食管鱗癌患者中也發(fā)現(xiàn)，相比癌旁正常組織，miR-664b-5p在食管癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異倍數(shù)為3.73，這與本課題組前期研究結(jié)果相一致，但哈薩克族患者中差異倍數(shù)更大，提示miR-664b-5p在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。因此進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中研究miR-664b-5p對(duì)食管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。

本研究同時(shí)在EC9706和TE-1兩株食管癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-664b-5p模擬物或抑制劑，運(yùn)用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-664b-5p的表達(dá)水平，確定最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件滿足后續(xù)功能研究。無限增殖、逃避凋亡以及侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤的重要特征，過表達(dá)miR-664b-5p后兩株食管細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力降低。相反，下調(diào)miR-664b-5p兩株食管細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯高于陰性對(duì)照組。Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-664b-5p后兩株食管癌細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，而抑制miR-664b-5p的表達(dá)后食管癌細(xì)胞中Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高，提示過表達(dá)miR-664b-5p后細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)敏感，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜合以上結(jié)果表明miR-664b-5p能抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在食管癌中發(fā)揮類似抑癌基因的作用。Song et al[10]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-664b-5p后降低了乳腺癌1號(hào)基因(BRCA1)突變的三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抑制miR-664b-5p的表達(dá)則出現(xiàn)相反的結(jié)果，這與本研究結(jié)果相一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白E2(CCNE2)為miR-664b-5p的下游靶基因[10]。

CCNE2在肺癌[11]、乳腺癌[10]等多種腫瘤中表達(dá)增加。在G1期/S期CCNE2與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2(CDK2)形成復(fù)合物磷酸化Rb，使轉(zhuǎn)錄因子E2F從磷酸化的Rb蛋白上分離，游離的E2F可促進(jìn)DNA合成，推動(dòng)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期[12]。miR-664b-5p可與CCNE2 mRNA的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合降解CCNE2 mRNA，抑制CCNE2蛋白的表達(dá)，阻止細(xì)胞周期進(jìn)程由G1期轉(zhuǎn)換到S期，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用[10]。由此推測，食管鱗癌中miR-664b-5p可能通過抑制CCNE2的表達(dá)從而發(fā)揮抑癌作用。而miR-664b-5p也可能通過多個(gè)靶基因發(fā)揮抑癌作用，后期可進(jìn)一步利用生物信息學(xué)分析miR-664b-5p的下游靶基因并通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)，通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明其介導(dǎo)miR-664b-5p的抑癌作用。

目前普遍認(rèn)為癌中高表達(dá)的基因常常發(fā)揮促癌作用，本研究發(fā)現(xiàn)在哈薩克族食管鱗癌中高表達(dá)的miR-664b-5p發(fā)揮著抑癌基因的作用。可能的原因如下：當(dāng)細(xì)胞增殖異常加速分裂時(shí)，細(xì)胞反饋性增加了抑癌基因的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，故而可能表現(xiàn)為抑癌基因表達(dá)的升高。哈薩克族食管鱗癌中miR-664b-5p高表達(dá)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明miR-664b-5p抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為闡明miR-664b-5p在哈薩克族食管鱗癌進(jìn)展中的分子機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。