邢孔蕓，陳玉蓉，李 慶，黎先萍，王 霞，蔡月紅，吳文婷，羅 慶

宮頸癌在全球范圍內(nèi)居于婦科腫瘤發(fā)病率第二位，國際癌癥研究機構(gòu)(international agency for research on cancer，IARC)統(tǒng)計，在2012年有52.8萬婦女被診斷患有宮頸癌，導(dǎo)致了該年26.6萬婦女死亡[1]。宮頸癌對于女性、家庭甚至社會都造成了極大的危害。據(jù)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，絕大多數(shù)宮頸癌患者存在人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染情況，同時HPV也被認為是導(dǎo)致宮頸癌產(chǎn)生的首要因素[2]。HPV感染的終生風險超過75% ，然而HPV影響到宮頸癌發(fā)生發(fā)展的具體機制并不明確，因此在宮頸癌疾病的發(fā)生以及發(fā)展過程中，對相關(guān)因子水平進行檢測非常關(guān)鍵，已發(fā)展成為臨床研究的熱門課題。YES相關(guān)蛋白(yes associated protein,YAP)是Hippo信號通路中的靶基因，屬于一種原癌基因，在哺乳動物中，YAP的功能主要在腫瘤細胞中實現(xiàn)，在腫瘤細胞的增殖、耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移以及抗凋亡中都發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路能夠激活轉(zhuǎn)化生長因子α(transforming growth factor α，TGF-α)及表皮生長因子受體(epidermal growth factor，EGFR)的表達[3]，已有研究證實，EGFR以及TGF-α在宮頸癌細胞的增殖以及生長構(gòu)成中具有非常重要的作用[4]。該研究對EGFR以及TGF-α蛋白在HPV亞型陽性宮頸癌細胞以及HPV陰性宮頸癌細胞中的表達情況進行分析，探討HPV感染后宮頸癌細胞的相關(guān)分子機制的改變，并對YAP蛋白影響HPV感染陽性患者EGFR以及TGF-α表達調(diào)節(jié)作用進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 HPV-16(+)Ca Ski人宮頸癌細胞、HPV(-)C33a人宮頸癌細胞、HPV-18(+)C4-1人宮頸癌細胞、本研究所涉及細胞均購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco 公司；免疫組化試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒購自日本TAKARA公司；SuperReal熒光定量試劑盒以及總RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海天根生化科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；YAP單克隆抗體、EGFR單克隆抗體、TGF-α單克隆抗體以及GAPDH單克隆抗體購自美國Abcam公司；YAP抑制劑Vertepofin購于美國MCE公司。

1.2 方法

1.2.1細胞免疫組織化學(xué)法檢測HPV(+)及HPV(-)宮頸癌細胞中YAP、TGF-α及EGFR的表達 分別將Ca Sk細胞、 C4-1細胞以及C33a細胞以1×104個/ml的密度種于無菌蓋玻片上，待細胞貼壁后，洗片、固定，在濃度為0.5 %的聚乙二醇辛基苯基醚中進行孵育，封閉一段時間后加入一抗，調(diào)整合適溫度后過夜，洗片后將二抗加入，然后進行染色處理，完成染核后進行蘇木精復(fù)染，然后將其放在儀器中進行檢測。每個視野觀察細胞，進行評分：1分：陽性染色細胞數(shù)≤25%；2分：陽性染色細胞數(shù)占>25%～<50%；3分：陽性染色細胞數(shù)≥50%。根據(jù)染色強度評分：0分：無染色；1分：淡黃色；2分：黃色；3分：棕黃色。等級表達是兩者之間的乘積0～1分為陰性(-)，2～5分為弱陽性(+)，5～9分及為陽性()。陽性細胞所占總細胞百分比進行判定。

1.2.2Western blot 檢測 HPV(+)及HPV(-)宮頸癌細胞中YAP、TGF-α及EGFR蛋白的表達 對宮頸癌Ca Ski細胞、C4-1細胞及C33a細胞進行蛋白常規(guī)提取，進行蛋白定量、定性檢測，然后進行配膠、電泳等操作，完成轉(zhuǎn)膜后使用BSA進行封閉，然后加入一抗，調(diào)整溫度后過夜，進行洗膜處理，將二抗加入，調(diào)整溫度過夜，然后進行顯影工作液配置，進行觀察。

1.2.3Vertepofin 對宮頸癌細胞增殖的影響 分別給予HPV(+)宮頸癌Ca Ski細胞、C4-1細胞YAP抑制劑Vertepofin 10 μmol/L，將細胞接種于6孔板，每24 h臺盼藍染色后細胞計數(shù)，繪制細胞生長曲線。

1.2.4Western blot 檢測 Vertepofin干預(yù)后YAP、TGF-α及EGFR蛋白的表達 宮頸癌Ca Ski細胞、C4-1細胞分別給予Vertepofin干預(yù)后48 h，進行蛋白常規(guī)提取，然后進行蛋白定性、定量測定，進行配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜處理，使用BSA封閉液進行封閉，將一抗加入后過夜，進行洗膜處理，然后將二抗加入，調(diào)整合適溫度進行孵育過夜，加顯影工作液后進行觀察。

1.2.5Realtime PCR檢測Vertepofin干預(yù)后YAP、TGF-α及EGFR mRNA的表達 宮頸癌Ca Ski細胞、C4-1細胞分別給予Vertepofin干預(yù)后48 h后，然后進行總RNA提取，并將其轉(zhuǎn)為cDNA，取PCR產(chǎn)物15 μl置于瓊脂糖凝膠中，濃度為1.2%，其中含有溴化乙啶0.5 μg/ml，進行常規(guī)電泳分離，圖像處理在凝膠成像儀中進行，對各組目的基因的表達情況進行觀察，然后對各電泳條帶進行灰度分析，后進行20 μl反應(yīng)體系配置，mRNA表達情況根據(jù)Super Real熒光定量試劑盒說明進行檢測，引物序列見表1。

表1 引物序列及擴增片段長度

2 結(jié)果

2.1 細胞免疫組化法檢測人宮頸癌細胞YAP、TGF-α、EGFR結(jié)果通過免疫組化在鏡下的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，HPV(+)的2組細胞Ca Ski與C4-1其YAP、TGF-α、EGFR的表達均高于HPV(-)的細胞C33a。其中Ca Ski細胞YAP(+)及EGFR(+)細胞比例較C33a提高(P<0.05)，YAP()、TGF-α()及EGFR()細胞比例高于C33a細胞(P<0.05)。C4-1細胞中TGF-α(+)及EGFR(+)細胞的比例高于C33a細胞(P<0.05)，而YAP()、TGF-α()及EGFR()細胞比例高于C33a細胞(P<0.05),見表2、圖1。

2.2 Western blot檢測人宮頸癌細胞YAP、TGF-α、EGFR結(jié)果通過比較發(fā)現(xiàn)，在HPV(-)的C33a細胞中，YAP及EGFR呈低表達狀態(tài)，YAP及EGFR的表達在HPV(+)的Ca Ski及C4-1細胞中高于C33a細胞(P<0.05)。3組細胞的TGF-α表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

表2 人宮頸癌細胞YAP、TGF-α、EGFR表達的比較(%)

圖1 YAP、TGF-α和EGFR在三種細胞株中的表達 ×400

表3 Vertepofin干預(yù)后三組細胞增殖抑制的比較(×104)

圖2 不同宮頸癌細胞中YAP、TGF-α及EGFR蛋白表達差異

2.3 YAP抑制劑Vertepofin干預(yù)對宮頸癌細胞細胞生長曲線的改變對C33a細胞、Ca Ski細胞及C4-1細胞進行YAP抑制劑Vertepofin處理，并進行連續(xù)細胞計數(shù)，結(jié)果顯示，C4-1和Ca Ski細胞中，加入Vertepofin后6 d，細胞增殖速度出現(xiàn)了的下降，較未加入Vertepofin組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在未加入Vertepofin前，C33a細胞的增殖速度低于HPV(+)的Ca Ski細胞及C4-1細胞，加入Vertepofin后，C33a細胞的增殖速度在第8天較未加入Vertepofin組出現(xiàn)了的降低。但總體而言，Vertepofin對于HPV(+)細胞的增殖抑制作用高于HPV(-)細胞，見表3。

2.4 Western blot檢測YAP抑制劑干預(yù)后宮頸癌細胞中YAP、TGF-α、EGFR蛋白表達結(jié)果通過結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HPV(+)的Ca Ski及C4-1細胞中YAP的表達高于C33a組，并且給予YAP抑制劑后，在抑制HPV(+)的Ca Ski及C4-1細胞中YAP蛋白的同時，也會抑制TGF-α及EGFR的表達(P<0.05)，給予C33a細胞Vertepofin后，僅有EGFR的表達出現(xiàn)了抑制(P<0.05),見圖3。

圖3 Vertepofin干預(yù)后對于宮頸癌細胞中YAP、TGF-α及EGFR蛋白表達的影響與 Vertepofin(-)比較：*P<0.05

2.5 RT-PCR檢測宮頸癌細胞YAP、TGF-α、EGFR mRNA在YAP抑制劑干預(yù)后表達結(jié)果進行抑制劑干預(yù)，對HPV(+)宮頸癌細胞YAP、TGF-α、EGFR mRNA定性及定量的比較發(fā)現(xiàn)，當給予Vertepofin后，在YAP mRNA被抑制的同時，TGF-α及EGFR的表達也出現(xiàn)了抑制(P<0.05),但在C33a細胞中除了EGFR的表達被抑制(P<0.05)，YAP及TGF-α的表達均無改變(P>0.05)，見圖4。

3 討論

最初在果蠅中發(fā)現(xiàn)Hippo/YAP信號通路對于不同種類細胞增殖可以起到調(diào)節(jié)作用[5]。Hippo信號通路的主要下游效應(yīng)物為YAP。在乳腺癌中，永生化乳腺上皮細胞MCF1-A的致癌轉(zhuǎn)變受過度表達的YAP誘導(dǎo)，對于顆粒細胞腫瘤細胞增殖可以起到顯著刺激作用[6]。據(jù)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中高危HPV亞型起到非常重要的作用，但是，目前對于高危HPV病毒調(diào)控宮頸癌相關(guān)因子的作用機制并無統(tǒng)一定論。曾有研究指出，當宮頸癌細胞HT3被HPV病毒感染后，會加快HT3的增殖速度，且伴有YAP、磷酸化YAP升高情況，在將YAP基因經(jīng)siRNA敲除后，可抑制由HPV病毒感染所導(dǎo)致的腫瘤細胞增殖[7]。這一結(jié)果可以看出，宮頸癌細胞HPV病毒感染的重要介質(zhì)包含YAP。本研究顯示，在HPV(+)的宮頸癌細胞中，YAP的表達增高，YAP(+)、()細胞比例高于C33a(P<0.05)，在本研究中進一步證明了YAP與HPV感染宮頸癌的聯(lián)系。Vertepofin是一種苯卟啉單環(huán)酸A，在研究中發(fā)現(xiàn)其可以抑制YAP的活性，研究指出，給予對紫杉醇耐藥的PDX細胞Verteporfin，對患者采用紫杉醇聯(lián)合維替泊芬治療可抑制YAP產(chǎn)生，進而提高抗腫瘤效果[8]。本研究中，給予宮頸癌細胞YAP抑制劑Verteporfin干預(yù)，抑制mRNA以及YAP的蛋白表達，且HPV陽性宮頸癌細胞增殖速度降低，結(jié)果說明，對于HPV陽性宮頸癌患者抑制YAP表達可抑制其腫瘤細胞增殖，同時這種抑制效果在HPV(+)宮頸癌細胞中較HPV(-)宮頸癌細胞中更為明顯。

圖4 Vertepofin干預(yù)后對宮頸癌細胞YAP、TGF-α及EGFR mRNA的影響與Vertepofin(-)比較:*P<0.05

在進一步研究YAP蛋白調(diào)節(jié)HPV(+)的宮頸癌的相關(guān)機制中，我們對YAP與TGF-α及EGFR的關(guān)系進行了探討。研究證實在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中與TGF-α有著密切聯(lián)系[9]。EGFR可攜帶于多種腫瘤細胞中，且可以形成期配體家族，因此認為其家族成員可能在腫瘤微環(huán)境旁分泌以及自分泌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究[10-11]指出，在基底乳腺癌細胞MDA-231中檢測EGFR配體的表達，其中AREG/TGF-α和HBEGF為表達最高的配體，當抑制TGF-α的表達后，細胞增殖降低，血管生成減少，腫瘤生長變慢。本研究發(fā)現(xiàn)，通過對宮頸癌細胞檢測TGF-α及EGFR的表達發(fā)現(xiàn)，HPV(+)的Ca Ski與C4-1細胞中，與HPV(-)C33a細胞比較，TGF-α與EGFR的表達升高，說明是否感染HPV與宮頸癌中TGF-α與EGFR的表達情況有著密切聯(lián)系。YAP作為重要的致癌基因，在腫瘤細胞以多種形式存在，當抑制YAP的表達后，腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲等都會隨之受影響[12]。本研究中，在對HPV(+)宮頸癌細胞進行檢測時發(fā)現(xiàn)，存在EGFR、TGF-α以及YAP表升高情況，而這一升高在HPV(-)的C33a細胞中并未發(fā)現(xiàn)。HPV感染宮頸癌細胞EGFR以及TGF-α表達與YAP蛋白的關(guān)系，用YAP抑制劑Verteporfin干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當給予YAP抑制劑Verteporfin后，在HPV(+)宮頸癌細胞中，伴隨著YAP蛋白的被抑制TGF-α及EGFR蛋白及mRNA的水平均出現(xiàn)了不同程度的抑制，而在HPV(-)的宮頸癌細胞中僅出現(xiàn)了EGFR基因的下調(diào)，說明YAP基因在HPV(+)宮頸癌細胞中對腫瘤細胞的抑制作用及對TGF-α及EGFR的調(diào)節(jié)作用更加顯著。

本研究初步證明，在HPV病毒感染宮頸癌細胞后，可調(diào)高YAP表達，且同時出現(xiàn)EGFR、TGF-α升高情況，在對YAP基因表達進行抑制后，可同時降低EGFR、TGF-α表達，證明YAP對HPV病毒感染的宮頸癌細胞中EGFR以及TGF-α表達可起到正調(diào)控作用，可以通過抑制YAP的表達在HPV病毒感染的宮頸癌治療中靶向TGF-α及EGFR，為宮頸癌治療提供新的靶點和治療途徑。