李征遠(yuǎn)，胡 培，周 琳，單勐也，郭興榮

心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見(jiàn)病，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)[1]。全世界每年死于心血管疾病的人數(shù)高達(dá)1 500萬(wàn)，居各種死因首位[2-3]。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病可導(dǎo)致血管重構(gòu)，而血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移是引起血管重構(gòu)的重要因素之一，也是一些心血管疾病發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵始動(dòng)因素之一[4-10]。相關(guān)研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體水平升高可誘導(dǎo)血管生成。而自噬相關(guān)蛋白ATG5在外泌體形成中發(fā)揮重要作用[14-15]，但ATG5、內(nèi)皮細(xì)胞外泌體及平滑肌細(xì)胞增殖之間的關(guān)系尚不明了。因此，該研究通過(guò)siRNA干擾內(nèi)皮細(xì)胞ATG5蛋白的合成，研究其所產(chǎn)生的外泌體對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響，探討ATG5介導(dǎo)下的內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間的信息傳遞，并利用共聚焦高內(nèi)涵成像分析儀示蹤平滑肌細(xì)胞攝取外泌體的過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料新生兒臍帶由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)婦自愿捐贈(zèng)，Ⅱ型膠原酶、DMEM/F-12 培養(yǎng)基以及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶、DAPI以及cy3/FITC標(biāo)記的熒光二抗購(gòu)自武漢碧云天生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)actorⅧ、CD31、Pan-Cadherin、SM22-α和α-actin抗體購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)公司；Hsp70、CD9、CD63、TSG101抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；外泌體于武漢谷歌生物科技有限公司進(jìn)行電鏡鑒定；PKH67 MINI67-1KT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，siRNA及轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱、SORVALL MX150+超高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus有限公司，共聚焦高內(nèi)涵成像分析儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離 20 cm健康足月剖腹產(chǎn)新生胎兒臍帶收集于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院婦產(chǎn)科，在無(wú)菌條件下用 PBS 沖洗干凈，分離臍帶中管壁薄、腔略大的臍靜脈。用去掉針頭的無(wú)菌注射器和 PBS 沖洗臍靜脈管腔，直至流出液澄清。用止血鉗夾閉臍帶一端，從另一端灌注0.1% Ⅱ型膠原酶至臍靜脈充盈，并用止血鉗封閉臍靜脈，37 ℃消化30 min，收集消化液至等體積含有10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，混勻后將收集液1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用含10% FBS 的 DMEM/F-12 培養(yǎng)基重懸后再次離心，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基(10% FBS+DMEM/F-12+100 μg/ml青霉素+100 μg/ml 鏈霉素)制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種至25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24 h 后觀察細(xì)胞貼壁狀況并更換培養(yǎng)液，以后每隔1～2 d換液。

1.2.2小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分離 將SD小鼠斷頸處死，在無(wú)菌條件下取其胸主動(dòng)脈，清除結(jié)締組織，完整剝離動(dòng)脈外膜并縱向剖開(kāi)血管，將血管內(nèi)膜向上平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，刮除內(nèi)膜并將其剪成約1 mm2的小組織塊，以0.5 cm的間距將組織塊分布于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底朝上并注入4 ml完全培養(yǎng)基(20% FBS+DMEM/F-12+100 μg/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素),置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5～6 h，待組織塊附著于瓶底，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，待有細(xì)胞從組織塊周圍擴(kuò)展出后換液，以后每隔1～2 d換液。

1.2.3細(xì)胞鑒定 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征通過(guò)倒置相差顯微鏡鑒定，細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物通過(guò)免疫熒光鑒定。將細(xì)胞傳至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%，棄培養(yǎng)上清液；用PBS清洗2次，免疫熒光固定液室溫固定30 min；用PBS清洗3次，每次5 min；加入免疫熒光封閉液，室溫封閉30 min；棄封閉液，用PBS清洗3次，每次5 min；分別加入內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)志物(FactorⅧ、CD31、Pan-Cadherin)、平滑肌細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)志物(SM22-α和α-actin)一抗，4 ℃過(guò)夜孵育；用PBS清洗3次，每次5 min；加入二抗搖床避光孵育2 h；用PBS清洗3次，每次5 min；加入DAPI，室溫孵育10 min，用PBS清洗3次，每次5 min；用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞采用含有10% FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d換液。小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞采用含有20% FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液。兩種細(xì)胞的傳代均待細(xì)胞融合至85%后，用PBS清洗3次，加入含有0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞皺縮成圓形時(shí)，立即加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞于離心管中，1 500 r/min離心3 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基，按1 ∶2的比例接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.5人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的提取與鑒定 Gibco小牛血清41 100 r/min 4 ℃離心10 h，取上層澄清液體即為無(wú)外泌體血清。用無(wú)外泌體血清配置的無(wú)外泌體完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，收集48 h細(xì)胞培養(yǎng)上清液60 ml，在4 ℃環(huán)境下，于高速離心機(jī)中分別以1 200 r/min離心10 min，3 100 r/min離心10 min以及16 600 r/min離心30 min連續(xù)離心的方法去除上清液中的懸浮細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片、microvesicle及凋亡小體等雜質(zhì)；用0.22 μm濾膜過(guò)濾離心后上清液；41 100 r/min超速離心70 min后棄上清液；用1 ml PBS重懸底部沉淀即為外泌體懸液。外泌體鑒定利用Western blot檢測(cè)蛋白標(biāo)志物Hsp70、CD9、CD63、TSG101。同時(shí)，利用電子顯微鏡對(duì)所提取的外泌體進(jìn)行大小和完整性鑒定。

1.2.6高內(nèi)涵示蹤平滑肌細(xì)胞攝取外泌體 外泌體的熒光標(biāo)記利用PKH67試劑盒，實(shí)驗(yàn)按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。超速離心后得到的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體棄上清液，用250 μl Diluent C重懸外泌體；同時(shí)，取1 μl PKH67稀釋于750 μl Diluent C中；將重懸后的外泌體和稀釋后的PKH67混勻室溫靜置10 min；加入1 ml 0.5%的BSA以結(jié)合過(guò)量的染料；41 100 r/min超速離心70 min后棄上清液，并重懸于平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，即得到PKH67標(biāo)記的外泌體。將標(biāo)記后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體與已貼壁生長(zhǎng)的小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞共同培養(yǎng)，利用共聚焦高內(nèi)涵成像分析儀的40倍鏡和共聚焦模式對(duì)其進(jìn)行成像，分析小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的攝取情況。

1.2.7ATG5-siRNA轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的第8代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞均勻接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞密度達(dá)40%，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)加入ATG5-siRNA1(靶序列：5′-GATTCATGGAATTGAGCCA-3′)和ATG5-siRNA2(靶序列：5′-GAAGTTTGTCCTTCTGCTA-3′)共轉(zhuǎn)染，陰性對(duì)照組加入NC-siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟參照廣州銳博生物科技有限公司siRNA產(chǎn)品使用說(shuō)明。轉(zhuǎn)染48 h后分別收集細(xì)胞總蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ATG5蛋白表達(dá)情況。

1.2.8高內(nèi)涵檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞外泌體影響平滑肌細(xì)胞增殖 siRNA轉(zhuǎn)染第8代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48 h后換無(wú)外泌體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外泌體。將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的第12代小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞接種于24孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)后換無(wú)外泌體完全培養(yǎng)基，并按0、100、200 μg/ml的濃度分別加入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外泌體。利用高內(nèi)涵明場(chǎng)成像和DPC模式實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)平滑肌細(xì)胞增殖情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有結(jié)果以及圖形分別利用PowerPoint、ImageJ、Harmony4.8、GraphPad Prism 6軟件處理和統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和免疫熒光鑒定原代分離的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)2 d后呈現(xiàn)明顯地貼壁生長(zhǎng)。通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察，單個(gè)細(xì)胞在形態(tài)上呈長(zhǎng)梭形、多角形或橢圓形，是典型的鵝卵石樣形態(tài)(圖1A1)。原代細(xì)胞在培養(yǎng)7 d后融合度達(dá)85%(圖1A2)。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物Pan-Cadherin和CD31，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物Factor Ⅷ的免疫熒光結(jié)果(圖1B)顯示，96%的細(xì)胞呈Cy3陽(yáng)性。Pan-Cadherin和CD31陽(yáng)性細(xì)胞的Cy3熒光主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞間的連接處上，符合Pan-Cadherind和CD31的膜蛋白的定位。Factor Ⅷ陽(yáng)性細(xì)胞的Cy3熒光主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，熒光染色范圍明顯小于CD31和Pan-Cadherin陽(yáng)性細(xì)胞。

圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定和免疫熒光結(jié)果

2.2 小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和免疫熒光鑒定在倒置相差顯微鏡下，小鼠胸主動(dòng)脈組織塊貼壁培養(yǎng)3 d可明顯觀察到有細(xì)胞(即為P0代平滑肌細(xì)胞)從組織塊邊緣游離出來(lái)；培養(yǎng)5 d，游離細(xì)胞融合度達(dá)75%；培養(yǎng)7 d，游離細(xì)胞融合度達(dá)90%。經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察P1代平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞大多呈長(zhǎng)梭形，少數(shù)呈多角形(圖2A)。血管平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志蛋白SM22-α和α-actin的免疫熒光結(jié)果顯示，95%的細(xì)胞呈Cy3陽(yáng)性(圖2B)。

2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的鑒定蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，超速離心法提取的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體含有外泌體標(biāo)志蛋白Hsp70、TSG101、CD9和CD63(圖3A)。電子顯微鏡下觀察所提取的外泌體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，直徑為50～150 nm(圖3B)。

2.4 平滑肌細(xì)胞攝取內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的熒光示蹤在共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)(HCS)40倍共聚焦成像模式下，利用DAPI(藍(lán)色)染色追蹤小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，利用PKH67(綠色)染色追蹤外泌體。高內(nèi)涵記錄共培養(yǎng)0、30、60、120、240 min時(shí)平滑肌細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取情況。結(jié)果顯示小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在共培養(yǎng)30 min后開(kāi)始攝取PKH67標(biāo)記的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體，共培養(yǎng)4 h后，平滑肌細(xì)胞攝取的外泌體明顯增多(圖4)。

圖3 外泌體的鑒定

2.5 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞siRNA干擾組的ATG5蛋白合成明顯降低實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖5)顯示在siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，實(shí)驗(yàn)組ATG5蛋白表達(dá)明顯降低。

2.6 高內(nèi)涵揭示ATG5介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞外泌體調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖本研究利用高內(nèi)涵DPC模式對(duì)隨機(jī)視野中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行96 h的不間斷統(tǒng)計(jì)得到平滑肌細(xì)胞的增殖曲線(圖6)，表明siRNA干擾人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ATG5表達(dá)后分泌的外泌體在濃度達(dá)到200 μg/ml時(shí)能夠明顯抑制小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖(圖6)。通過(guò)組間分析，與對(duì)照組比較，外泌體濃度為200 μg/ml時(shí)，平滑肌細(xì)胞的增殖曲線存在顯著差異(P<0.01)。

3 討論

眾所周知，除了毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管外，血管壁主要由三層膜結(jié)構(gòu)組成，內(nèi)膜由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，中膜(中動(dòng)脈)主要由平滑肌細(xì)胞參與構(gòu)成，外膜由疏松結(jié)締組織組成。血管平滑肌細(xì)胞在構(gòu)成血管壁、維持血管張力上發(fā)揮著重要作用，而它的異常增殖和遷移在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞是血液與組織之間的一道具有半透膜性質(zhì)的屏障，能夠分泌多種活性因子，其內(nèi)皮細(xì)胞損傷或功能障礙可引發(fā)系列心血管疾病。例如，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后釋放的細(xì)胞因子使血液中白細(xì)胞貼壁引發(fā)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)中層血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，并伴隨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和沉積，造成粥樣硬化等。由此可見(jiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間存在信息交流，相互影響，共同維持著內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但是其作用機(jī)制目前尚不明了。

圖4 HCS示蹤平滑肌細(xì)胞攝取PKH67標(biāo)記的外泌體

圖5 SiRNA干擾HUVEC ATG5表達(dá)的Western blot鑒定

圖6 高內(nèi)涵DPC模式監(jiān)測(cè)VSMC增殖曲線

外泌體是包含了核酸、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的小囊泡，廣泛存在于血液、尿液、腦脊液、乳汁等體液之中。外泌體可通過(guò)與受體細(xì)胞的細(xì)胞膜融合或與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合釋放活性內(nèi)容物，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞，調(diào)控機(jī)體的生命活動(dòng)，也與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)程密切相關(guān)。

在乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白ATG5通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞多囊泡體的pH來(lái)影響外泌體的形成，和參與微管相關(guān)蛋白的酶促級(jí)聯(lián)修飾并將催化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至外泌體，介導(dǎo)外泌體促進(jìn)臨近乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。敲除ATG5基因的乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生外泌體的量顯著下降且外泌體內(nèi)不含微管相關(guān)蛋白相關(guān)催化產(chǎn)物。在肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧和炎癥可誘導(dǎo)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的釋放，并引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖和遷移。

血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化是心血管病，如動(dòng)脈粥樣硬化，發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵始動(dòng)因素之一。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為材料，研究siRNA干擾ATG5蛋白合成的內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)利用共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)示蹤平滑肌細(xì)胞攝取內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的過(guò)程，為探索調(diào)控平滑肌細(xì)胞異常增殖提供新的思路。

本研究結(jié)果顯示，小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)30 min后開(kāi)始攝取內(nèi)皮細(xì)胞外泌體；通過(guò)siRNA干擾ATG5蛋白合成的內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體在200 μg/ml濃度時(shí)可以顯著抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。但ATG5如何影響內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的產(chǎn)生，是否依賴于自噬，還是直接作用于外泌體形成的相關(guān)蛋白尚有待研究。另外，在siRNA干擾內(nèi)皮細(xì)胞ATG5蛋白合成后，所產(chǎn)生的外泌體中組分是否發(fā)生質(zhì)和量的改變，外泌體進(jìn)入平滑肌細(xì)胞后是通過(guò)何種信號(hào)通路來(lái)調(diào)控增殖尚有待考察。

綜上所述，本研究揭示了ATG5能夠介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞外泌體來(lái)調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖，為平滑肌細(xì)胞功能異常而導(dǎo)致的心血管疾病的防治提供了新的思路，但調(diào)控的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。