朱 波，解 爽，張思瑩，陳 淵，胡漫輝，溫聰娜，劉偉華，問 明，張 濤，劉經(jīng)緯，李日恒

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率近年來均保持上升趨勢，嚴重威脅人類健康[1-2]。DNA甲基化是表觀遺傳學分子機制之一，在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用[3-4]。腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域CpG島高甲基化導致其轉(zhuǎn)錄沉默已被認為是腫瘤發(fā)生的一個共同特征[5-6]，由此通過去甲基化藥物使抑癌基因重新表達為腫瘤治療提供了新的思路和途徑。普魯卡因(procaine，PCA)作為一種新型去甲基化劑，在人乳腺癌細胞系MCF-7[7]、胃癌細胞系SGC-7901[8]中具有生長抑制的作用。然而，PCA對結(jié)腸癌細胞DNA甲基化調(diào)節(jié)以及生物學功能的影響鮮見報道，該研究以人結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細胞作為研究對象，探討 PCA對Septin9基因甲基化狀態(tài)和表達水平的影響及其抑制細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑人結(jié)腸癌細胞株DLD-1購于武漢普諾賽生命科技有限公司；人結(jié)腸癌細胞株HCT116購于石家莊華沃科瑞生物科技有限公司；RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；血清購于美國BI公司；MTS試劑盒購于美國Promega公司；重亞硫酸鹽DNA甲基化試劑盒購于德國Qiagen公司；總RNA提取試劑盒購于美國Omega公司；逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司；引物設計及合成由上海生物工程有限公司完成。

1.2 主要儀器與設備全波長酶標儀(型號：Epoch)購于美國Bio Tek公司；流式細胞儀(型號：CytoFLEX)購于美國BECKMAN公司；倒置相差顯微鏡(型號：ECLIPSE Ts2)購于日本Nicon公司；熱循環(huán)儀(型號：Veriti)、熒光定量PCR儀(型號：7300)購于美國BioSystems公司。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌DLD-1細胞用含10%血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)腸癌HCT116細胞用含10%血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2MTS檢測細胞增殖活力 取處于對數(shù)生長期的DLD-1、HCT116細胞，每孔按5×103個接種至96孔板，每孔體積約100 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；待細胞密度生長至70%以上，加處理因素；分別設對照組和PCA處理組，處理組藥物濃度設為1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L 4個濃度，每組設4個復孔；在培養(yǎng)24、48、72 h時加入MTS液20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，于酶標儀上讀取490 nm吸光度值，計算細胞生長抑制率。

1.3.3形態(tài)學觀察 胰蛋白酶消化并收集DLD-1、HCT116細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；待細胞貼壁后分別設對照組和PCA處理組，處理組藥物終濃度為2 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；倒置顯微鏡下觀察DLD-1、HCT116細胞形態(tài)變化。

1.3.4流式細胞術檢測細胞周期及凋亡 調(diào)整DLD-1、HCT116細胞密度至2×105個/孔接種于6孔板，每孔體積約4 ml，DLD-1、HCT116細胞PCA終濃度為2 mmol/L，每組設3個復孔，同時設不加藥對照孔，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h后收集細胞以進行染色，流式細胞儀上機檢測。

1.3.5Transwell實驗檢測細胞遷移 無血清培養(yǎng)基重懸DLD-1、HCT116細胞濃度至2.5×105個/ml；在24孔板中預先加入800 μl含10%血清的培養(yǎng)基并放入Transwell小室，1 h后在上室分別接入200 μl細胞懸液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；取出小室，擦去上層細胞，PBS清洗后70%冰乙醇固定1 h；0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6BGS檢測Septin9甲基化狀態(tài) 甲基化Septin9上游引物為5’-GGATGAATAGTGGGGAATAGTATTG-3′，下游引物為5′-CAAAAAAAACCCTAAAAAATCACC-3′，擴增片段234 bp。根據(jù)制造商的說明書，用細胞DNA提取試劑盒從DLD-1、HCT116細胞中提取總DNA，用重亞硫酸鹽DNA甲基化試劑盒進行DNA甲基化檢測。

1.3.7qRT-PCR檢測Septin9表達水平 Septin9上游引物為5′-ACTGCTGCCTCTACTTCA-3′，下游引物為5′-CTGGTGATGTCCTTGATGT-3′，擴增片段300 bp。β-actin上游引物為5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物為5′-TGGAAGGTGGACAGCGA GG-3′，擴增片段550 bp。根據(jù)Omega試劑盒說明書，提取DLD-1、HCT116細胞總RNA，cDNA逆轉(zhuǎn)錄和目的片段擴增按照TaKaRa試劑盒說明書進行操作，記錄Ct值進行分析。

2 結(jié)果

2.1 PCA抑制DLD-1、HCT116細胞增殖MTS檢測結(jié)果顯示，不同時間點上，PCA處理后，DLD-1、HCT116細胞的抑制率隨著PCA濃度的增加(1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L)呈上升趨勢，高濃度(2.5 mmol/L)對細胞的增殖抑制最明顯。見圖1A、B。且PCA對DLD-1、HCT116細胞的生長抑制有濃度依賴性和時間依賴性。見表1、2。結(jié)果表明藥物作用的最佳濃度為2.0 mmol/L，最佳時間為48 h。與此同時，倒置顯微鏡觀察顯示，DLD-1細胞生長密度下降，細胞體積縮小；HCT116細胞皺縮成團，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象并從它們生長的表面回縮。見圖1C。

圖1 PCA抑制DLD-1、HCT116細胞的增殖

PCA濃度(mmol/L)24 h48 h72 hF/H值P值1.010.80±1.3216.27±1.19▼20.90±1.35▼▲45.978<0.0011.515.63±1.02*22.53±1.59▼30.97±1.46▼▲92.953<0.0012.021.03±2.34*#42.57±5.65▼*#52.13±9.31▼*#18.3930.0032.527.37±3.46*#&44.87±4.35▼*#60.67±7.34▼▲*#29.4620.001F/H值30.12744.72728.099P值<0.001 < 0.001 < 0.001

PCA濃度 (mmol/L)24 h48 h72 hF/H值P值1.08.73±0.8119.00±1.49▼25.90±1.35▼▲142.180<0.0011.514.63±1.12*20.97±1.81▼30.17±1.45▼▲82.689<0.0012.021.97±2.08*#41.53±4.01▼*#55.73±7.28▼▲*#35.2740.0012.528.50±1.75*#&47.83±1.29▼*#&60.90±9.59▼▲*#24.7270.001F/H值95.634108.80225.241P值<0.001<0.001<0.001

2.2 PCA阻滯DLD-1、HCT116細胞于G2/M期流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，PCA處理后，DLD-1細胞S期細胞比例(37.81±3.36)%和G2/M期細胞比例(26.89±3.98)%高于對照組S期細胞比例(33.29±4.52)%和G2/M期細胞比例(17.94±3.00)%；HCT116細胞G2/M期細胞比例(43.64±7.53)%高于對照組G2/M期細胞比例(28.92±4.68)%；兩者處理前后比較，G2/M期細胞比例差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 PCA促進DLD-1、HCT116細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，PCA處理后，DLD-1細胞總凋亡率為(11.15±0.64)%，明顯高于對照組(4.32±0.07)%；HCT116細胞總凋亡率為(11.93±1.16)%，明顯高于對照組(4.65±1.30)%；兩者處理前后比較，總凋亡率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖2 PCA處理前后DLD-1、HCT116細胞周期A：DLD-1細胞；B：HCT116細胞；與對照組比較：*P<0.05

圖3 PCA處理前后DLD-1、HCT116細胞凋亡率A：DLD-1細胞；B：HCT116細胞；與對照組比較：*P<0.05

2.4 PCA抑制DLD-1、HCT116細胞遷移結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，PCA處理前后，DLD-1細胞跨膜數(shù)分別為(34.00±7.55)、(16.60±5.24)個；HCT116細胞跨膜數(shù)分別為(34.33±7.77)、(13.53±5.64)個；兩者處理前后比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

2.5 PCA逆轉(zhuǎn)Septin9高甲基化狀態(tài)亞硫酸氫鈉測序結(jié)果顯示，PCA作用于DLD-1、HCT116細胞后，Septin9啟動子區(qū)域CpG位點甲基化平均水平分別為(45.20±2.48)%、(48.63±1.24)%，均低于對照組(63.50±2.76)%、(68.24±2.34)%，兩者比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

2.6 PCA上調(diào)Septin9表達水平qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，PCA處理后，DLD-1細胞Septin9 mRNA相對表達量為(6.43±0.54)，明顯高于對照組(1.00±0.19)；HCT116細胞Septin9 mRNA相對表達量為(8.60±1.00)，明顯高于對照組(1.00±0.17)。兩者比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個多因素、多階段的復雜過程，涉及一系列經(jīng)典遺傳學和表觀遺傳學事件的積累。根據(jù)KNUDSON提出經(jīng)典的腫瘤發(fā)生的“二次打擊理論”，表觀遺傳異常改變在結(jié)腸癌發(fā)生過程中發(fā)揮著更重要的作用。Septin9是抑癌基因家族成員之一，其高甲基化會導致自身表達異常，從而失去正常的抑癌作用。研究[9]表明Septin9基因高甲基化及轉(zhuǎn)錄缺失見于多種腫瘤。

圖4 PCA處理前后DLD-1、HCT116細胞遷移 × 200 A：DLD-1細胞；B：HCT116細胞；與對照組比較：*P<0.05

圖5 PCA處理前后DLD-1、HCT116細胞Septin9甲基化狀態(tài)

圖6 PCA處理前后DLD-1、HCT116細胞Septin9 mRNA表達量

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位碳原子上。由于DNA甲基化不同于經(jīng)典遺傳學改變，具有可逆性的特點，因此可以應用DNMTs抑制劑逆轉(zhuǎn)DNA甲基化，使得抑癌基因重新被激活，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用，這對于腫瘤治療來說是十分有意義的[10]。PCA是臨床常用的局部麻醉藥物，也是常見的非核苷類DNMTs抑制劑之一，能夠逆轉(zhuǎn)多種實體腫瘤的惡性生物學行為。Xuan et al[7]研究發(fā)現(xiàn)PCA對人乳腺癌細胞具有生長抑制作用，其對乳腺癌細胞DNA甲基化的抑制作用是通過抑癌基因的活化發(fā)揮的。Li et al[8]在對人胃癌SGC-7901細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PCA可以通過上調(diào)抑癌基因CDKN2A和RARβ的表達來抑制胃癌細胞的增殖并且促進其凋亡。方潔 等[11]通過對人膀胱癌T24細胞的研究發(fā)現(xiàn)，PCA可以抑制膀胱癌細胞的增殖，誘導其凋亡，將腫瘤細胞阻滯于G0/G1期。Ying et al[12]通過研究發(fā)現(xiàn)PCA能抑制人骨肉瘤MG63細胞增殖和遷移，同時通過上調(diào)腫瘤抑制基因MiR-133b促進骨肉瘤細胞的凋亡。在非小細胞肺癌A549、NCI-H1975細胞株和其他的一些腫瘤模型中，PCA也表現(xiàn)出了潛在的治療作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCA抑制結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細胞的增殖和遷移能力，并且對其生長抑制有濃度依賴和時間依賴效應；PCA能顯著誘導結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細胞凋亡，并且主要將細胞阻滯在G2/M期。未經(jīng)PCA處理的結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細胞，其Septin9基因 5’端啟動子區(qū)域CpG島出現(xiàn)不同程度的甲基化，而使用去甲基化藥物PCA處理后，Septin9基因的甲基化程度明顯下降。進一步通過qRT-PCR檢測Septin9基因的表達水平，結(jié)果顯示，PCA處理后Septin9 mRNA的表達量明顯增加。以上結(jié)果表明，PCA能夠通過逆轉(zhuǎn)Septin9甲基化，上調(diào)其表達水平，從而抑制結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細胞的增殖。

目前已報道的DNMTs抑制劑主要分為核苷類抑制劑和非核苷類抑制劑。地西他濱在幾種核苷類抑制劑中具有最強的去甲基化作用，并且被用于初治及難治復發(fā)MDS等惡性血液病患者的治療[14]，但由于常導致患者出現(xiàn)嚴重的胃腸道反應和表現(xiàn)出骨髓毒性而限制了其廣泛的臨床應用[15]。可能是由于核苷類抑制劑通過在DNA復制過程中摻入新合成的DNA分子發(fā)揮作用。而非核苷類抑制劑PCA由于其毒副作用小、價格便宜、特異性強等優(yōu)點，具有更廣闊的臨床應用前景，未來有望成為基于表觀遺傳學結(jié)腸癌治療的安全候選藥物。