朱芳蕓, 張霞婧, 馮 燕, 翟 茜,邵勇平, 王 強

大腦是人體最為敏感的器官，發(fā)生腦缺血時，缺血時間越長腦組織損害越大，釋放的興奮性氨基酸谷氨酸越多，繼而過度激活與之相結(jié)合的突觸后膜受體N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA)，引起鈣離子超載，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡或者壞死，由于體內(nèi)缺乏谷氨酸降解酶，因此谷氨酸的轉(zhuǎn)運主要靠細胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(Excitatory amino acid transporters, EAATs)，谷氨酸轉(zhuǎn)運體中EAAT2完成谷氨酸轉(zhuǎn)運的90%，因此EAAT2是最重要的谷氨酸轉(zhuǎn)運體[1]。大鼠腦缺血前給予電針(electroacupuncture，EA)刺激即預(yù)處理可產(chǎn)生腦保護作用[2]，該研究采用結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈(Bilateral common carotid artery occlusion ,BCCAO)完成全腦缺血損傷模型，旨在探討電針預(yù)處理腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級雄性C57BL/6小鼠32只，12周齡，體質(zhì)量18～23 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心，飼養(yǎng)于通風良好，室溫(23±2)℃，濕度(50±5)%，自然光照，自由進食飲水。隨機數(shù)表分4組(n=8)：全腦缺血再灌注(BCCAO)組、電針預(yù)處理(EA+BCCAO)組、EAAT2抑制劑二氫卡因酸鹽(DHK)+EA+BCCAO組、EAAT2激動劑頭孢曲松鈉(CXT)+BCCAO組。所有動物均遵循“NIH實驗用動物管理和使用指南”，盡量減少實驗動物數(shù)量和動物所受的痛苦，以及善待動物等。

1.2 方法

1.2.1實驗動物處理 BCCAO組結(jié)扎動脈20 min；EA+BCCAO組麻醉后G6805-Ⅱ電針儀(青島鑫升實業(yè)有限公司)電刺“百會穴”，參數(shù)：電流強度1 mA，頻率2/15 Hz，疏密波，30 min/次/d，持續(xù)5 d，預(yù)處理后24 h結(jié)扎動脈20 min；DHK+EA+BCCAO組同EA+BCCAO組，結(jié)扎動脈前1 h注射DHK(批號：26All 12592，Tocris Bioscience公司，美國)200 μg/kg于側(cè)腦室給藥[3]，末次處理24 h結(jié)扎動脈20 min；CXT+BCCAO組腹腔注射CXT(批號：SHl455，上海羅氏有限責任公司) 600 mg/kg，1次/d，連續(xù)5 d。

1.2.2全腦缺血再灌注損傷模型制備 預(yù)處理后24 h結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈完成全腦缺血再灌注損傷模型[3]。將動物以InterMed AV600s麻醉機(Penlon公司，英國) 3%異氟醚吸入麻醉后，繼續(xù)經(jīng)異氟醚維持麻醉，保持自主呼吸，仰臥位固定動物，在頸正中部位顯露游離并結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈20 min。缺血成功的標準：嘴唇發(fā)紺和呼吸急促，眼球蒼白和瞳孔散大；松開結(jié)扎線進行再灌注，再灌注成功的標準：瞳孔縮小，嘴唇紅潤，呼吸頻率規(guī)律。

1.2.3神經(jīng)行為學(xué)評分和海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元觀察 再灌注24 h，按運動功能評分(total motor scores，TMS)[4]進行神經(jīng)功能觀察,由不清楚分組的一員執(zhí)行。評分后，深麻醉暴露心臟，經(jīng)升主動脈持續(xù)灌注肝素鈉和4%多聚甲醛各20 ml，斷頭取腦組織，制備石蠟切片，進行HE染色，BX51多功能熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)觀察，隨機選取5個視野，統(tǒng)計CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)取平均值，凋亡神經(jīng)元指：外形塌陷呈多角形或三角形，胞核溶解或固縮，胞漿嗜伊紅染色。每個小鼠取3張切片，取均值。

1.2.4Western blot法 斷頭取海馬腦組織，KeyGEN全蛋白提取試劑盒提取蛋白，并蛋白定量。30 μg總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 200 V 2 h分離，Bio-Rad電泳儀將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，放入5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，滴加兔源性β-tubulin(1 ∶5 000，康為世紀生物科技公司，北京)和兔源性EAAT2(1 ∶1 000，Abcam公司，英國)4 ℃孵育24 h，使用洗膜緩沖液漂洗，滴入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(1 ∶1 000，科昊生物，西安)室溫孵育1 h，洗膜緩沖液漂洗，最后將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光液，采用Bio-Rad掃描和發(fā)光。EAAT2的蛋白表達量：目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-tubulin灰度值的比值來表示。

1.2.5免疫熒光雙標染色 先暴露心臟，經(jīng)升主動脈，0.9%肝素鈉生理鹽水20 ml持續(xù)灌注，然后4%多聚甲醛緩沖液20 ml繼續(xù)并行腦組織固定，后斷頭分離含有海馬的腦組織浸入4%多聚甲醛緩沖液4 ℃固定，然后先在20%的蔗糖，再用30%蔗糖繼續(xù)脫水。以10 μm厚度為冠狀切片切腦片。切片晾干，洗滌后使用兔源性GFAP(1 ∶600，Abcam，英國)和豚鼠源性GLT-1(1 ∶200，Millipore，美國)混合液4 ℃孵育36 h，再次洗滌后加入山羊抗兔Cy3(1 ∶200，Abcam，英國)和抗豚鼠FITC(1 ∶200，Abcam，英國)室溫避光孵育1 h。最后甘油密封熒光顯微鏡下觀察 。

2 結(jié)果

2.1 電針預(yù)處理對全腦缺血再灌注小鼠行為的影響與BCCAO組(3.0±0.5)分比較，EA+BCCAO組(7.1±0.3)分和CXT+BCCAO組(6.7±0.8)分行為學(xué)評分增加(t=11.77與t=10.25，P<0.05)；與EA+BCCAO組比較，DHK+EA+BCCAO組(2.3±0.3)分行為學(xué)評分降低(t=14.45，P<0.05)。

2.2 電針預(yù)處理對全腦缺血-再灌注小鼠海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元的影響與BCCAO組(36.1±3.0)個比較，EA+BCCAO組(15.2±2.0)個和CXT+BCCAO組(12.5±2.0)個凋亡神經(jīng)元數(shù)目減少(t=19.96，t=24.31，P<0.05)；與EA+BCCAO組比較，DHK+EA+BCCAO組(38.0±1.0)個凋亡神經(jīng)元數(shù)目增加(t=18.22，P<0.05)。見圖1。

圖1 小鼠海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)目變化 ×400

2.3 電針預(yù)處理對全腦缺血-再灌注小鼠海馬CA1區(qū)EAAT2表達的影響Western blot結(jié)果：與BCCAO組比較，EA+BCCAO組和CXT+BCCAO組EAAT2蛋白表達增加(t=7.028，t=4.243，P<0.05)；與EA+BCCAO組比較，DHK+EA+BCCAO組EAAT2蛋白表達降低(t=4.692，P<0.05)。見圖2A。免疫熒光雙標染色結(jié)果：BCCAO組EAAT2蛋白表達較少，EA+BCCAO組和CXT+BCCAO組EAAT2表達增加，而DHK+EA+BCCAO組EAAT2表達減少。GFAP在EA+BCCAO和CXT+BCCAO組蛋白表達增加。EAAT2-GFAP熒光染色在EA+BCCAO和CXT+BCCAO組增強，說明兩者蛋白表達增加。見圖2B。

圖2 Western blot和免疫熒光雙標染色檢測EAAT2的蛋白表達情況

3 討論

腦卒中是發(fā)展中國家導(dǎo)致人群死亡的第二因素，我國卒中每年新增200多萬例，但目前對其預(yù)防沒有特別有效的措施[5]。C57BL/6小鼠因Willis環(huán)先天發(fā)育不全，因此可結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈制備全腦缺血再灌注損傷模擬人類腦卒中[6]。使用電針刺激特異性穴位“百會穴”可以產(chǎn)生大鼠“腦缺血耐受”作用[7]。當腦部受到傷害或發(fā)生缺血損傷時，過量的谷氨酸積聚會導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死，而胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT包括5型，其中星形膠質(zhì)細胞上的EAAT2更為重要，在腦損傷時EAAT2主動轉(zhuǎn)運谷氨酸到胞內(nèi)，進一步被谷氨酰胺合成酶降解為無神經(jīng)毒性的谷氨酰胺[8-10]。實驗發(fā)現(xiàn)小鼠腦缺血前給予電針預(yù)處理，與BCCAO組比較神經(jīng)行為學(xué)評分增加和海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)目減少。說明電針預(yù)處理可以減輕小鼠腦缺血損傷作用，產(chǎn)生腦保護作用。EAAT2拮抗劑DHK，因不能透過血腦屏障，選擇側(cè)腦室給藥[3]。末次電針預(yù)處理結(jié)束，側(cè)腦室給予DHK，給藥1 h后制作腦缺血再灌注損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHK可以逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護作用。CXT是EAAT2的特異性激動劑，連續(xù)腹腔注射可上調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運體數(shù)目，起到腦缺血保護效果，本研究采用CXT腹腔注射預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)行為學(xué)評分明顯提高和CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)目降低，這與電針預(yù)處理產(chǎn)生作用相似[11]，提示EAAT2參與電針預(yù)處理產(chǎn)生腦缺血耐受作用。

Western blot結(jié)果顯示小鼠全腦缺血再灌注損傷組EAAT2蛋白表達上調(diào)，說明腦缺血損傷激活了谷氨酸轉(zhuǎn)運體，而電針預(yù)處理提高EAAT2的蛋白表達水平。EAAT2不僅分布于皮層，而且海馬也非常豐富，因此免疫熒光染色雙標選擇GFAP和EAAT2，結(jié)果顯示EA+BCCAO組EAAT2表達明顯增強，GFAP蛋白表達也明顯多于BCCAO組，雙標定位EAAT2-GFAP細胞數(shù)目明顯比BCCAO組增加，結(jié)論電針預(yù)處理的腦保護作用通過上調(diào)星形膠質(zhì)細胞膜上的EAAT2來實現(xiàn)的。

綜上所述，小鼠腦缺血前給予電針刺激產(chǎn)生的腦保護是通過上調(diào)星形膠質(zhì)細胞上的EAAT2來實現(xiàn)的，這也為臨床使用電針刺激儀預(yù)防和治療腦卒中奠定了一定的理論基礎(chǔ)。但這一技術(shù)如何應(yīng)用于臨床還有待繼續(xù)研究。