孫丹丹，馬晴晴，徐元宏，鄭美娟

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)為最常見的致死性腫瘤之一，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染在其發(fā)病中具有重要作用[1]。研究表明HCC患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可高表達(dá)CTLA-4，從而介導(dǎo)免疫負(fù)向調(diào)控[2]。亦有研究表明CD8+T細(xì)胞中存在類似CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的細(xì)胞亞群，稱為CD8+Treg[3-4]，包括CD8+CD25+Treg、CD8+CD103+Treg以及CD8+CD28-Treg，參與抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的功能[5]。NK細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，有研究表明在肝癌患者中NK細(xì)胞比例降低且效應(yīng)功能降低[6]。

該研究通過檢測HBV陽性的HCC患者外周血CD8+CD25+Treg以及CD8+CD103+Treg以及NK細(xì)胞的水平，同時(shí)分析CD8+CD25+Treg與NK細(xì)胞的相關(guān)性，進(jìn)而探討HCC可能的免疫逃逸機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018年1月～2020年1月期間55例HCC患者及22例健康對照者臨床資料。

1.2 主要試劑與儀器FITC-CD4、FITC-CD56、FITC-CD103、PE-CD25、Percp-cy5.5-CD3、Percp-cy5.5-CTLA-4、APC-CD8、APC-FoxP3、紅細(xì)胞裂解液均購自美國BD公司；細(xì)胞固定液和穿膜液購自美國賽默飛公司；Ficoll液購自天津TBD公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司；4 ℃離心機(jī)為德國Eppendorf公司。

1.3 樣本采集采集患者外周血分別置于分離膠管和EDTA抗凝管；EDTA抗凝血用于流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+CD103+Treg、CD8+CD25+Treg、CTLA-4+CD8+Treg、CD4+Treg、CTLA-4+CD4+Treg和NK細(xì)胞的比例。

1.4 PBMC的分離取1支15 ml離心管，加入2 ml Ficoll液，采集2 ml患者或健康人的抗凝全血，使用PBS進(jìn)行1 ∶1稀釋。然后將稀釋后的血液緩慢加入Ficoll液面上方，注意不要破壞液面。然后于水平離心機(jī)中1 900 r/min，升0降0離心30 min后，使用平口吸管吸取中間白膜層，即為外周血PBMC。

1.5 CD8+CD25+Treg、CD8+CD103+Treg、CD8+CTLA-4+Treg和NK細(xì)胞的檢測在流式管中加入全血50 μl，加入10 μl小鼠血清室溫避光封閉10 min，再分別加入相應(yīng)抗體FITC-CD103/PE- CD25/Percp-cy5.5-CD3/APC-CD8或FITC-CD56/Percp-cy5.5-CD3各10 μl；混勻后流式管置于室溫、避光孵育15 min；然后加入紅細(xì)胞裂解液1 ml，混勻后流式管置于室溫，避光孵育10 min，PBS洗滌2次，300 μl PBS重懸細(xì)胞沉淀，F(xiàn)ACSCanto II Plus儀器檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析結(jié)果。

1.6 CD4+CD25+FoxP3+Treg和CTLA-4+CD4+Treg細(xì)胞的檢測在流式管中加入全血50 μl，加入10 μl小鼠血清室溫避光封閉10 min，再分別加入相應(yīng)抗體FITC-CD4/PE- CD25/Percp-cy5.5-CTLA-4各10 μl；混勻后流式管置于室溫、避光孵育15 min；然后加入紅細(xì)胞裂解液1 ml，混勻后流式管置于室溫，避光孵育10 min， PBS洗滌2次，加入100 μl細(xì)胞固定液置于4 ℃冰箱避光固定40 min，然后加入1 ml穿膜液，洗滌棄上清液后加入10 μl APC-FoxP3抗體。避光孵育1 h后，加入1 ml PBS洗滌2次，300 μl PBS重懸細(xì)胞沉淀，F(xiàn)ACSCanto II Plus儀器檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料55例HCC患者中男性44例，女性11例，年齡35～73歲，中位年齡58歲，四分位數(shù)間距為20.00歲。22例健康對照組中男性13例，女性9例，年齡28～77歲，中位年齡52歲，四分位數(shù)間距為20.75歲。

2.2 HCC患者外周血CD8+Treg比例及組織中CTLA-4+CD8+Treg比例的檢測利用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血HCC患者CD8+Treg的比例，設(shè)計(jì)方案如圖1A。我們發(fā)現(xiàn)，HCC患者組外周血CD8+CD25+Treg比例為(6.22±0.49)%，高于健康對照組為(4.56±0.44)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t=1.996)，代表性流式圖見圖1B，統(tǒng)計(jì)圖見圖1E。同時(shí)，CTLA-4+CD8+Treg在患者癌組織中表達(dá)比例(41.00±4.00)%也高于癌旁組織(6.23±2.75)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t=7.158)，代表性流式圖見圖1D,統(tǒng)計(jì)圖見圖1G。此外，我們檢測患者組CD8+CD103+Treg比例為(2.92±0.22)%，與健康對照組(2.69±0.37)%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，t=0.437)，代表性流式圖見圖1C，統(tǒng)計(jì)圖見圖1F。

圖1 HCC患者外周血CD8+Treg的比例

2.3 HCC患者組織中CD4+Treg比例的檢測利用流式細(xì)胞術(shù)檢測HCC患者癌組織中及癌旁組織中CD4+Treg的比例，發(fā)現(xiàn)癌組織中CD4+CD25+FoxP3+Treg比例為(23.28±6.78)%，高于癌旁組織中(10.18±4.04)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t=1.965)，代表性流式圖見圖2A，統(tǒng)計(jì)圖見圖2B。CTLA-4+CD4+Treg在癌組織中(61.53±11.37)%比例也高于癌旁組織(16.33±2.38)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t=3.889)，代表性流式圖見圖2C，統(tǒng)計(jì)圖見圖2D。

2.4 HCC患者外周血及組織中NK細(xì)胞表達(dá)比例的檢測利用流式細(xì)胞術(shù)檢測HCC患者外周血NK細(xì)胞的比例，患者外周血NK細(xì)胞表達(dá)比例為(13.57±1.39)%低于健康對照組(21.44±1.23)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t=4.227)，代表性流式圖見圖3A，統(tǒng)計(jì)圖見圖3B?；颊甙┙M織中NK比例為(8.99±1.64)%，低于癌旁組織中NK細(xì)胞比例(24.13±3.10)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t=4.314)，代表性流式圖見圖3C，統(tǒng)計(jì)圖見圖3D。

圖2 HCC患者癌組織和癌旁組織中CD4+Treg的比例

圖3 HCC患者外周血及肝組織中NK細(xì)胞比例

2.5 HCC患者NK細(xì)胞含量與CD8+Treg以及CD4+Treg含量的相關(guān)性分析為進(jìn)一步探究HCC患者NK細(xì)胞與CD8+Treg、CD4+Treg的相關(guān)性，本研究分析了外周血NK細(xì)胞與CD8+CD25+Treg含量的相關(guān)性，結(jié)果表明二者呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.66，P<0.05)，見圖4A。接下來分析癌組織中NK細(xì)胞與CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者同樣呈負(fù)相關(guān)(r=-0.76,P<0.05)，見圖4B。

圖4 HCC患者NK細(xì)胞與CD8+Treg、CD4+Treg的相關(guān)性

3 討論

HCC在我國發(fā)病例數(shù)較高，研究表明腫瘤細(xì)胞為避免機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊，具有免疫逃逸的機(jī)制。CD4+Treg、CD8+Treg細(xì)胞是具有免疫負(fù)調(diào)功能的免疫細(xì)胞[7-9]，參與腫瘤細(xì)胞逃逸、免疫監(jiān)視和防御。亦有研究[10]指出CTLA-4可以增強(qiáng)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。NK細(xì)胞作為固有免疫細(xì)胞，參與機(jī)體抗腫瘤免疫，有研究[11-12]表明患者的NK細(xì)胞能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。而在HCC患者中，CD4+Treg和CD8+Treg具體參與何種角色，與NK細(xì)胞有何相關(guān)目前尚不清楚。

研究[13]表明HCC患者與健康對照者比較外周血中具有高比例的CD8+Treg。在本研究中，HCC患者外周血CD8+CD25+Treg細(xì)胞比例升高且CTLA-4+CD8+Treg細(xì)胞在癌組織中比例明顯高于癌旁組織，這提示在腫瘤患者體內(nèi)CD8+Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制作用可能要高于正常機(jī)體。對CD4+Treg進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，在癌組織中同樣存在CD4+CD25+Foxp3+Treg以及CTLA-4+CD4+Treg的高表達(dá)，提示CD4+Treg細(xì)胞也參與了這一免疫抑制過程。本研究中顯示的上述細(xì)胞亞群的上調(diào)現(xiàn)象，可能是導(dǎo)致患者抗腫瘤免疫功能減低的重要原因。而在這兩種Treg細(xì)胞中均高表達(dá)的CTLA-4，提示它可能同樣參與了腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，然而這種現(xiàn)象的產(chǎn)生的原因及其具體影響機(jī)制并不清晰。

本研究顯示NK細(xì)胞在HCC患者外周血及癌組織中表達(dá)降低，這與前期研究[14]報(bào)道相符。通過相關(guān)性分析顯示外周血CD8+CD25+Treg、癌組織中CD4+Treg的比例與NK細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān),提示他們之間可能存在某種關(guān)聯(lián),與HCC的免疫逃逸相關(guān)。

總之，通過分析Treg細(xì)胞與NK細(xì)胞的關(guān)系，提示這兩種細(xì)胞都可以參與HCC患者體內(nèi)異常的免疫反應(yīng)過程，且CTLA-4在此過程中可以抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤作用，其可能與HCC的進(jìn)展相關(guān)。因而對于設(shè)計(jì)抗腫瘤免疫方案具有重要的參考價(jià)值及臨床應(yīng)用前景。