周 琳，楊 慧，吳夢楠，蔡文靜，鄭營雪

種植技術現(xiàn)已廣泛應用于牙列缺損和牙列缺失的修復，由于其不傷鄰牙、支持固位作用好、異物感小的優(yōu)點，逐步替代了固定橋修復及活動修復技術。種植體周圍炎可引起種植體周圍軟組織的炎癥反應及結合骨喪失一系列病變，嚴重時可導致種植體脫落，甚至治療失敗[1]。種植體周圍炎是一種菌斑生物膜介導的疾病，現(xiàn)階段有眾多學者研究其治療方法[2-3]，如刮治、藥物、激光、手術治療等，但存在治療操作的局限性、致病菌耐藥性、手術創(chuàng)傷大、花費高等不足。近來有學者發(fā)現(xiàn)了一種新型抗菌制劑——抗菌肽。乳酸鏈球菌素(Nisin)是乳酸鏈球菌亞種分泌的細菌素，無毒性，具有良好的穩(wěn)定性，不易產(chǎn)生耐藥性[4]，且現(xiàn)階段研究證據(jù)支持Nisin抗菌肽對齲齒和牙周疾病相關致病菌的抗菌特性[4]。MTAN(a mixture of nisin, acid, and detergent)是將MTAD(a mixture of tetracycline isomer, acid, and detergent)中的多西霉素用Nisin抗菌肽替換，由Nisin粉、吐溫-80、檸檬酸、無菌水配制而成，其具有良好的抗菌作用[5-6]，但對種植體周圍炎致病菌的作用國內(nèi)尚未有研究。該研究擬探討MTAN對種植體周圍炎致病菌及生物膜的抑制作用，為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalisBNCC 337441)、具核梭桿菌(F.nucleatumBNCC337608)、血鏈球菌(S.sanguinisBNCC134927)、Nisin(上海北諾生物科技有限公司)；檸檬酸(天津市瑞金特化學品有限公司)；EDTA粉(濟寧百川化工有限公司)。

1.2 主要儀器DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀(南京國營華東電子管廠)；DRAGONLABD2012型離心機(大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司)；掃描電子顯微鏡(美國FEI公司，型號Quanta 250FEG)。

1.3 方法

1.3.1MTAN、MTAN+EDTA溶液的配制 MTAN溶液每100 ml溶液中含Nisin粉3.0 g、檸檬酸粉4.5 g、0.5 ml吐溫-80、99.5 ml無菌水。MTAN+EDTA溶液每100 ml中含Nisin粉3.0 g、EDTA粉1.52 g、檸檬酸粉4.5 g、0.5 ml吐溫-80、99.5 ml無菌水。將兩種溶液Nisin的濃度稀釋為2 mg/ml，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2菌懸液的制備 牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復蘇后，分別接種在BHI血瓊脂培養(yǎng)基上，80% N2、20% CO2，37 ℃專性厭氧培養(yǎng)48 h。血鏈球菌復蘇后接種在BHI血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃兼性厭氧培養(yǎng)48 h。生化鑒定及革蘭染色證實為純菌后增菌培養(yǎng)，BHI血清培養(yǎng)液稀釋配置菌懸液濃度為2×108CFU/ml備用。

1.3.3最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)的測定 實驗組：MTAN組及MTAN+EDTA組Nisin濃度均為1.95、3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1 000 μg/ml。陽性對照組：100 μl 0.12%氯己定溶液。陰性對照組：100 μl無菌水；各組均加入100 μl菌懸液。測量記錄各孔混合液原始OD值，在光學顯微鏡下記陰性對照組細菌生存數(shù)，取平均值。將各組37 ℃厭氧下培養(yǎng)24 h，測量并記錄各孔OD值，其中MIC為OD值變化小于0.05的濃度。MBC為大于MIC的各濃度中細菌的生存數(shù)降低大于99.9%的最小濃度。

1.3.4牙骨質(zhì)片的制備 選用鄭州大學第一附屬醫(yī)院大學路門診(河南省口腔醫(yī)院)口腔頜面外科新鮮拔除的健康前磨牙，經(jīng)患者知情同意后，清除牙齒表面附著物，用高速渦輪手機磨取牙體鄰面牙根部牙骨質(zhì)片40片，大小約為4 mm×4 mm，超聲蕩洗、消毒后置于-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5MTAN、MTAN+EDTA對具核梭桿菌生物膜的影響 選取40個牙骨質(zhì)片試樣，隨機分為8組，A組為陰性對照組：無菌水處理組；B組為陽性對照組：含0.12%氯己定的處理組；C、D、E組是Nisin濃度依次為125、250、500 μg/ml的MTAN處理組；F、G、H組是Nisin濃度依次為125、250、500 μg/ml的MTAN+EDTA處理組。取牙骨質(zhì)片及無菌唾液于試管內(nèi)，形成獲得性膜，沖洗后放于24孔板中，每孔中置入1 000 μl菌液和1 000 μl BHI培養(yǎng)液，調(diào)整每孔中菌液濃度為1×108CFU/ml，專性厭氧培養(yǎng)48 h，取出試樣并沖洗游離菌，每孔中按分組加入不同濃度試劑1 000 μl，培養(yǎng)24 h后，將牙骨質(zhì)片清洗、固定、脫水、干燥，噴金，掃描電鏡下觀察生物膜情況。

2 結果

2.1 OD值法測得的MIC和MBC值OD值變化小于0.05的記為MIC，細菌生存數(shù)降低大于99.9%的最小濃度記為MBC，從而得出MTAN、MTAN+EDTA的MIC和MBC值。實驗結果得MTAN組，血鏈球菌的MIC和MBC值為31.3 μg/ml和125 μg/ml；具核梭桿菌的MIC和MBC值為62.5 μg/ml和250 μg/ml；牙齦卟啉單胞菌的MIC和MBC值為125 μg/ml和500 μg/ml。MTAN+EDTA組，血鏈球菌的MIC和MBC值為31.3 μg/ml和125 μg/ml；具核梭桿菌的MIC和MBC值為31.3 μg/ml和62.5 μg/ml；牙齦卟啉單胞菌的MIC和MBC值為62.5 μg/ml和250 μg/ml。

2.2 統(tǒng)計學分析根據(jù)實驗結果，統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)MTAN組：①S.sanguinis組Nisin濃度大于15.6 μg/ml的各組與陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；②F.nucleatum組Nisin濃度大于31.3 μg/ml的各組與陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；③P.gingivalis組Nisin濃度大于62.5 μg/ml的各組與陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MTAN+EDTA組：①S.sanguinis組Nisin濃度大于15.6 μg/ml的各組與陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；②F.nucleatum組Nisin濃度大于15.6 μg/ml的各組同陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；③P.gingivalis組Nisin濃度大于31.3 μg/ml的各組與陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

用繪圖軟件繪制同一藥液不同Nisin濃度作用不同細菌的OD值(生長濁度)對應關系的柱狀圖，由圖可見當Nisin的濃度大于一定值后各實驗組同陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 MTAN組不同nisin濃度與三種菌OD值的對應關系

2.3 電鏡掃描結果陰性對照組在5 000倍下可見牙骨質(zhì)片表面形成了具核梭桿菌生物膜，生物膜連續(xù)致密，表面粗糙，未見裂隙；20 000倍下生物膜內(nèi)具核梭桿菌相互交織呈網(wǎng)狀生長，菌體粗壯飽滿呈桿狀，數(shù)目密集。陽性對照組5 000倍下見生物膜連續(xù)，有散在孔隙，與陰性對照組比較，表面平坦略光滑；20 000倍下見細菌菌體短小，散在分布生長，數(shù)目明顯變少，見圖3。

圖2 MTAN+EDTA組不同nisin濃度與三種菌OD值的對應關系

圖3 無菌水及氯己定作用下的具核梭桿菌生物膜

MTAN組中Nisin 濃度為125 μg/ml時，生物膜連續(xù)性有輕度破壞，表面有裂隙出現(xiàn)，與陽性對照組比較，表面粗糙，菌體干癟但仍交織呈網(wǎng)狀，數(shù)目有減少；250 μg/ml時，生物膜的完整性明顯破壞，出現(xiàn)大的裂隙，細菌散在，數(shù)目明顯減少，可見明顯的不規(guī)則的球形或線形的死亡具核梭桿菌細胞；500 μg/ml時，生物膜表面大量的空洞、裂隙，偶有菌體細胞完整，見圖4。MTAN+EDTA組濃度為125 μg/ml時，生物膜可見明顯的破壞，出現(xiàn)孔洞和裂隙，與MTAN組比較，細菌數(shù)目減少，可見死亡的細菌細胞，250 μg/ml時，生物膜表面破壞嚴重，基本無細菌存活；500 μg/ml時生物膜的完整性不存在，可見到菌體裂解、消融，見圖5、6。

3 討論

口腔中多種微生物共存組成一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，正?？谇恢形⑸锱c宿主之間為共生關系，但某些特定時候這個平衡會被打破，微生物定性或者定量的變化會導致某些疾病的發(fā)生發(fā)展。通常情況下它們主要以非致病性生物膜的形式附著于種植體或者牙齒表面，當機體防御機制紊亂時，菌斑中某些細菌就轉變成了致病菌，可引起牙周組織的感染[7-8]。起初牙體或種植體表面形成獲得性膜，鏈球菌屬通過與表面的唾液蛋白相互作用附著于其上，改變局部生存環(huán)境，后具核梭桿菌定植，該菌充當“連接者”作用，并進一步改變局部環(huán)境，連接晚期定植者如牙齦卟啉單胞菌，使該生物膜轉變?yōu)榫哂兄虏⌒郧忠u性的菌斑生物膜。該菌斑生物膜內(nèi)細菌交互協(xié)同生存，明顯提高了細菌對口腔環(huán)境的適應能力以及對宿主的致病性，且相關研究表明臨床上牙菌斑對抗生素的耐藥能力及致病性更強[9]。

圖4 MTAN作用下具核梭桿菌生物膜情況

圖5 MTAN+EDTA作用下具核梭桿菌生物膜情況

圖6 Nisin濃度為500 μg/ml的MTAN+EDTA組具核梭桿菌菌體消融及裂解 ×40 000H3：消融;H4:裂解

本實驗研究了MTAN及MTAN+EDTA對種植體周圍炎致病菌：血鏈球菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌及生物膜的體外抑制效果。實驗研究采用了美國國立臨床實驗室標準化委員會推薦的藥物敏感實驗，標準肉湯稀釋法測定MTAN及MTAN+EDTA對3種致病菌的MIC及MBC值。結果顯示二者對3種致病菌均有較強的抑制作用，此二者對血鏈球菌的抑菌效果最強，具核梭桿菌居中，牙齦卟啉單胞菌最差。這個結果可能由于Nisin是一種兩親性的小分子生物抗菌肽，它可以通過與G+膜表面的陰離子脂質(zhì)結合或者特異性識別膜中脂質(zhì)Ⅱ并與其結合作用形成孔洞，這一成孔特性可以破壞多種G+菌細胞膜而產(chǎn)生抑菌作用，能有效抑殺多種G+菌，但其不能破壞G-表面的保護性外膜。血鏈球菌為G+菌，因此Nisin能直接破壞細胞膜，抑制其生物活性。由于MTAN中的檸檬酸為一種螯合劑，可以破壞G-菌表面的保護性外膜,故提高了具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌對Nisin的敏感度；且EDTA可以破壞保護性外膜并增加細胞膜通透性，從而促進Nisin進入細胞內(nèi)，提高其抗菌性。但添加EDTA后并沒有改變MTAN對血鏈球菌的抑菌效果，不過降低了MBC，可能與血鏈球菌本身是G+菌有關。根據(jù)研究結果提示MTAN、MTAN+EDTA可能會阻止早期致病性細菌生物膜的形成，進而降低種植體周圍炎的發(fā)生可能。且在眾多研究細菌的藥敏實驗中，細菌多為懸浮或者浮游狀態(tài)，然而在口腔內(nèi)細菌通常存在于牙菌斑中，并以多種細菌生存的生物膜形式存在。據(jù)相關研究表明，細菌在不同生存狀態(tài)下時交流方式是不同的，生物膜中細菌通過信號分子相互交流，且它們可通過某種閾值感應系統(tǒng)增強自身的毒力和存活能力。此外，與浮游狀態(tài)的細菌相比，生物膜狀態(tài)下的細菌更可能發(fā)生基因突變，可能增強其對藥物的耐藥性[10]。因此研究評估藥物對生物膜狀態(tài)下細菌的作用是十分必要的。

具核梭桿菌介導早期和晚期細菌的共聚，且有助于形成專性厭氧菌如牙齦卟啉單胞菌的生存條件，同時它還能增強牙齦卟啉單胞菌致病性。因此有必要研究Nisin對具核梭桿菌生物膜的抑制作用。本實驗集中研究了MTAN、MTAN+EDTA對具核梭桿菌生物膜的作用。根據(jù)實驗結果顯示，當MTAN和MTAN+EDTA中Nisin濃度為125 μg/ml時均對具核梭桿菌生物膜的生長有抑制作用，相比于陰性對照組，生物膜的連續(xù)性明顯破壞，菌體干癟短小，數(shù)目減少；與陽性對照組相似。隨著Nisin濃度的增加，生物膜的完整性破壞加重，細菌數(shù)目減少甚至無法存活，細菌菌體結構破壞，內(nèi)容物外溢、消融。以上結果表明，含有低濃度Nisin的MTAN及MTAN+EDTA對具核梭桿菌生物膜有較好的破壞作用，且能有效地抑制生物膜中的細菌。

綜上所述，在本實驗條件下，MTAN及MTAN+EDTA均能抑制種植體周圍炎三種致病菌的體外生長繁殖及對具核梭桿菌生物膜結構有破壞作用，且加EDTA后增加了牙齦卟啉單胞菌及具核梭桿菌對Nisin的敏感性。該研究為種植體周圍炎治療方法提供了理論依據(jù)。