陳 曦，王 鵬，徐 恰，劉 會(huì)，郭若文，劉 蕓，許 尹，秦宜德

阿爾茨海默病(alzheimer disease,AD)的特征在于存在由β-淀粉樣肽(β-amyloid peptides，Aβ)和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT) 組成的細(xì)胞外淀粉樣斑塊，其中細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)由患病腦中的過度磷酸化的TAU(pTAU)蛋白組成[1]。TAU是一種神經(jīng)元胞質(zhì)蛋白，可穩(wěn)定微管，從而使TAU能夠發(fā)揮其作為細(xì)胞骨架成分和軸突運(yùn)輸軌跡的作用。TAU是一種高度可溶的，天然解折疊的蛋白質(zhì)，幾乎沒有二級結(jié)構(gòu)[2]。細(xì)胞內(nèi)NFT的積累，主要由錯(cuò)誤折疊的TAU蛋白的聚集體組成以及廣泛的神經(jīng)變性。在正常情況下，TAU是一種結(jié)合并穩(wěn)定微管的軸突蛋白。異常的TAU過度磷酸化或其他改變導(dǎo)致其錯(cuò)誤折疊和從微管解離，隨后在細(xì)胞體和樹突中重新分布和寡聚，導(dǎo)致NFT形成并且導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。已有研究[4]證明過表達(dá)TAU-P301-L的小鼠(rTg4510小鼠)會(huì)出現(xiàn)與年齡相關(guān)的NFT，以及神經(jīng)元丟失和記憶障礙。并且TAU-P301-L的過表達(dá)會(huì)加速體外細(xì)胞模型中錯(cuò)誤折疊的TAU蛋白的聚集[5]。OPTN是一種重要的自噬受體，可促進(jìn)清除感染的病原體，線粒體和蛋白質(zhì)聚集體，它的功能眾多，包括介導(dǎo)囊泡運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。據(jù)報(bào)道[3]選擇性自噬受體(例如：SQSTM1、OPTN)可以通過自噬溶酶體途徑清除錯(cuò)誤折疊蛋白聚集體。

為了探究OPTN對AD的相關(guān)蛋白TAU在細(xì)胞水平的相互作用，該研究根據(jù)人類OPTN和TAU-P301-L基因設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得目的基因，再進(jìn)行重組過表達(dá)腺相關(guān)病毒的載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化，純化和包裝，成功構(gòu)建過表達(dá)OPTN和TAU-P301-L的腺相關(guān)病毒，TAU-P301-L基因在細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)為AD研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料OPTN和TAU-P301-L基因序列由上海生物工程技術(shù)有限公司合成；pAAV-IRES-ZsGreen1、pAAV-CMV-mkate-IRES、pAAV-RC9和pHelper購自上海諾百生物科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒購自上海生物工程技術(shù)有限公司；PBS、DMEM購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自康元生物科技有限公司；OPTN一抗購自美國Proteintech公司；TAU、β-actin一抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1腺相關(guān)病毒構(gòu)建 根據(jù)來自NCBI基因序列(OPTN，NM_001008211.1；TAU，NM_016834.5)設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物，委托上海生工用化學(xué)合成法合成目的基因。目的基因兩端設(shè)計(jì)有EcoRI和BamHI連接位點(diǎn)。pAAV-IRES-ZsGreen1帶有綠色熒光標(biāo)記基因，pAAV-CMV-mkate-IRES帶有紅色熒光標(biāo)記基因。

PCR擴(kuò)增OPTN基因，引物：F:5′-GCCTCCGCG GATTCGAAATGTCCCATCAACCTCTCAGCT-3′；R：5′- TTCAATCGATGTTCGAATTAAATGATGCAATCCA TCACGTGAATCTG-3′。PCR擴(kuò)增TAU-P301-L基因，引物：F：5′-TATGGCCACAGGATCCATGGCTGAG CCCCGC-3′；R：5′-TCATCGATATGGATCCTCACGTA GAATCGAGACCGAGGAG-3′。pAAV-IRES-ZsGreen1和pAAV-CMV-mkate-IRES用EcoRI和BamHI雙酶切后進(jìn)行膠回收獲得空載體。攜帶目的基因質(zhì)粒PCR高溫變性94 ℃ 60 s，低溫退火 55 ℃ 30 s，引物延伸 72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)，獲得的目的基因片段OPTN和TAU-P301-L，用T4連接酶使目的基因分別與空載體16 ℃過夜連接。連接完成后將目的基因產(chǎn)物與解凍后的感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30 min，之后42 ℃水浴熱擊90 s，再次冰浴10 min后加入不含AMP的1 ml培養(yǎng)基37 ℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)1 h后涂布于含有AMP的固體培養(yǎng)基的篩選板上培養(yǎng)。

1.2.2pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒陽性克隆鑒定 挑取篩選板上的單個(gè)菌落并重懸于含有10 μl AMP的10 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 r/min震蕩培養(yǎng)12 h后,將菌液委托上海生工測序，將測序結(jié)果與NCBI查詢結(jié)果進(jìn)行比對。

1.2.3pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5腺相關(guān)病毒包裝 將生長狀態(tài)良好的293T 細(xì)胞傳代培養(yǎng)。使用胰酶消化后離心，離心后加入1 ml培養(yǎng)基并吹打均勻。取20 μl于細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，將多次計(jì)數(shù)值取平均值后將細(xì)胞以4×105個(gè)/孔鋪于6孔板。在細(xì)胞融合度為80%～90%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將加入LipofiterTM2000轉(zhuǎn)染試劑和包裝質(zhì)粒pAAV-RC9、輔助質(zhì)粒pHelper的混合物共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞。24、48 h換液，轉(zhuǎn)染72 h后，將6孔板內(nèi)所有細(xì)胞收于離心管，將細(xì)胞裂解后4 ℃ 53 000 r /min 高速離心 30 h 后，收集富含AAV9病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒于-80 ℃保存。

1.2.4利用Real-time PCR測定重組腺相關(guān)病毒滴度 將病毒消化并使用PCR緩沖液稀釋成105、106、107、108、109、1010不同拷貝梯度，Real-time PCR測定，使用引物各0.4 μl，引物信息如下：F：5′-GAGTGGCCAACTCCATCACT-3′；R：5′-CGTTACTATGGGAACATACGT-3′。模板1 μl，去離子水3 μl。經(jīng)過95 ℃ 180 s 預(yù)變性，94 ℃ 30 s變性，62 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸， 40個(gè)循環(huán)之后4 ℃保存，利用統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5重組腺相關(guān)病毒對293T細(xì)胞的感染 將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×104個(gè)/孔鋪板在96孔板，24 h后在細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以MOI值(感染復(fù)數(shù)MOI值=病毒數(shù)量/細(xì)胞數(shù)量)分別為105、5×105、106三個(gè)梯度的pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5重組腺相關(guān)病毒加無血清DMEM培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)10 h后更換10%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在感染后48、72、96 h通過熒光顯微鏡觀察 GFP和RFP在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況，隨機(jī)選取視野計(jì)數(shù)表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)，觀察體外感染效率。

1.2.6RT-PCR 檢測蛋白表達(dá)分別取最適MOI值的pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5腺相關(guān)病毒對293T細(xì)胞感染48、72、96 h后，回收細(xì)胞并使用TRIzol 提取總RNA，再使用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄之后獲得cDNA進(jìn)行RT-PCR，在1%瓊脂糖凝膠電泳后成像分析，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參β-actin的灰度值比。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達(dá) 分別取最適MOI值的pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5腺相關(guān)病毒對293T細(xì)胞感染48、72、96 h后，回收細(xì)胞并加入RIPA裂解液，提出蛋白并測定濃度。配置10%分離膠，5%濃縮膠，Marker和蛋白上樣后以80 V恒壓電泳至濃縮膠平齊后，換120 V電壓直到出現(xiàn)溴酚藍(lán)指示劑。停止電泳，將在甲醇中激活后的PVDF膜貼在膠上以260 mA，2 h進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，在將PVDF膜于牛奶中封閉后一抗孵育4 ℃過夜，TBST 3×10 min洗膜后用二抗室溫1 h孵育，用熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像，所得條帶用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.8MTT檢測最適MOI值重組腺相關(guān)病毒對293T細(xì)胞的增值抑制率 將細(xì)胞消化吹打成懸液，以5 000個(gè)/孔接種于96孔板。培養(yǎng)過夜后，分為6組：空白對照組，MOI值均為106的pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN組，pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5組，pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN與pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5共同處理組。綠色AAV9對照病毒組和紅色AAV9對照病毒。分別在48、72、96 h后每孔加入20 μl MTT，CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，在酶標(biāo)儀上測定各孔490 nm波長的吸光度值(OD),以空白對照組計(jì)算增值抑制率：增值抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)×100%。方法見參考文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果

2.1 腺相關(guān)病毒質(zhì)粒構(gòu)建利用PCR獲取OPTN目的基因，OPTN長度為1 734 bp，插入到pAAV-IRES-ZsGreen1載體，插入位點(diǎn)為EcoRI和BamHI，載體中含有綠色熒光標(biāo)記基因;TAU-P-301L長度為1 194 bp，插入到pAAV-CMV-mkate-IRES載體，插入位點(diǎn)為EcoRI和BamHI，載體中含有紅色熒光標(biāo)記基因。將測序結(jié)果與NCBI中的cDNA序列對比后發(fā)現(xiàn)完全一致，證明構(gòu)建成功。

2.2 重組腺相關(guān)病毒的滴度測定利用Real-time PCR得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)公式計(jì)算 R平方值。根據(jù)曲線的函數(shù)公式，計(jì)算待測AAV 樣品對應(yīng)的拷貝數(shù)對數(shù)X，之后換算成拷貝數(shù)10 X及病毒滴度vg/ml。測得pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5腺相關(guān)病毒滴度都為1.0×1012vg/ml。

2.3 重組腺相關(guān)病毒對293T細(xì)胞感染的熒光鑒定將MOI值分別為106、5×105、105三個(gè)梯度的pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48、72、96 h通過倒置熒光顯微鏡觀察 GFP和RFP在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況。分別計(jì)數(shù)每孔中出現(xiàn)綠色熒光和紅色的細(xì)胞數(shù)后取平均值，結(jié)果顯示分別有 33.6%和20.5%的 HEK293 細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染。均可清晰看到綠色熒光和紅色熒光蛋白的表達(dá)，隨著感染時(shí)間增加各滴度病毒感染的 293T細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)。其中MOI值106組熒光最強(qiáng)確認(rèn)為最適MOI值。見圖1、2。

圖1 GFP在重組腺相關(guān)病毒感染293T細(xì)胞的表達(dá) × 200

圖2 RFP在重組腺相關(guān)病毒感染293T細(xì)胞的表達(dá) × 200

2.6 重組腺相關(guān)病毒對293T細(xì)胞感染的MTT鑒定與對照組比較，TAU-P301-L組AAV9病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制；與TAU-P301-L組相比，OPTN與TAU-P301-L組共同處理組增殖抑制減輕，細(xì)胞活力明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2 841，P<0.01；48 h SD=10.40 ，mean=17.62；72 h SD=11.63， mean=19.67；96 h SD=14. 03， mean=22.66)。見圖5。

圖3 重組腺相關(guān)病毒感染293T細(xì)胞的RT-PCR鑒定

圖4 Western blot檢測OPTN和總TAU蛋白的表達(dá)與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖5 MTT檢測重組腺相關(guān)病毒對293T細(xì)胞活力影響

3 討論

蛋白質(zhì)聚集體的積累是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理學(xué)特征，其特征是神經(jīng)元功能障礙和最終細(xì)胞死亡，過表達(dá)TAU-P301-L的轉(zhuǎn)基因小鼠(PS19小鼠)中觀察到海馬突觸喪失。 TAU的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致微管捆扎，這進(jìn)一步阻礙了線粒體的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致線粒體變性，ATP喪失和突觸變性，細(xì)胞凋亡。從AD腦中分離或體外產(chǎn)生的PHF-TAU 抑制了蛋白酶體的活性，因此可能不斷的干擾細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。類似的，在TAU過度磷酸化和聚集后，穩(wěn)定表達(dá)TAU的293T細(xì)胞中的蛋白酶體活性降低。NFT還可能通過降低正常的TAU功能而引起神經(jīng)元毒性。TAU突變體的抑制也會(huì)穩(wěn)定神經(jīng)元損失并改善記憶功能，緩解AD的癥狀[4]。錯(cuò)位的TAU是自發(fā)性溶酶體途徑降解的原因，它是神經(jīng)原纖維纏結(jié)的主要成分。選擇性自噬是大自噬的一種亞型，它需要貨物蛋白受體識別特定的靶標(biāo)，使其螯合在自噬體中并最終被溶解[3]。自噬主要是非選擇性的大量降解途徑，負(fù)責(zé)大部分長壽蛋白和某些細(xì)胞器的降解[8]。已有文獻(xiàn)證明[9]OPTN通過與自噬因子LC3相互作用并增強(qiáng)自噬導(dǎo)致神經(jīng)毒性的蛋白質(zhì)的包涵體裂解。在表達(dá)TAU的突變細(xì)胞中，尤其是在早期階段，細(xì)胞自噬途徑仍然可以發(fā)揮功能，并且其水平更高。 OPTN足以克服減弱的自噬作用，并與激活的溶酶體途徑協(xié)同作用，可有效指導(dǎo)病原性TAU的靶向清除，繼而TAU所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性減弱，細(xì)胞的增殖力恢復(fù)。MTT結(jié)果也顯示OPTN的表達(dá)降低了TAU-P301-L蛋白對細(xì)胞的毒性，AAV介導(dǎo)的OPTN表達(dá)導(dǎo)致TAU蛋白表達(dá)的強(qiáng)烈降低。本次實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的過表達(dá)OPTN和TAU-P301-L重組腺相關(guān)病毒具有較高的滴度，并且過表達(dá)OPTN和TAU-P301-L重組腺相關(guān)病毒在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞分別可以觀察到不同表達(dá)量的綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白，證明病毒載體高效感染細(xì)胞的能力。Western blot和RT-PCR檢測過表達(dá)OPTN和TAU-P301-L重組腺相關(guān)病毒可以有效表達(dá)OPTN蛋白和TAU-P301-L蛋白。本次研究成功構(gòu)建過表達(dá)OPTN和TAU-P301-L重組腺相關(guān)病毒，在細(xì)胞水平TAU-P301-L的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致TAU蛋白的磷酸化和異常TAU蛋白的積累[3]，為AD的體外造模提供捷徑，未來可以將過表達(dá)TAU-P301-L的病毒在動(dòng)物腦室進(jìn)行注射進(jìn)行體內(nèi)造模[10]，模擬AD的病理特征，為AD研究提供了有效的方法。