□ 秦鵬鈞 大連產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測研究院有限公司

近年來，世界各地區(qū)食品安全惡性事件頻繁發(fā)生。據(jù)報道，2020 年7月29 日，約旦首都安曼發(fā)生大規(guī)模食物中毒事件，導致至少700 人中毒，其中一名兒童死亡。此外，因食品安全問題，美國先后召回2 800 萬箱谷物早餐制品、5.5 億枚雞蛋。食品安全問題給各個國家和人民帶來了巨大的損失和痛苦。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測微生物時，受到食品環(huán)境脅迫或受損的微生物細胞通常需要在特殊的培養(yǎng)條件才能恢復生長，導致其難以被分離。發(fā)展及時、準確檢出食品中微生物的技術(shù)迫在眉睫，這一現(xiàn)象促進了以PCR 等為代表的分子生物學技術(shù)在食品微生物及相關(guān)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用和發(fā)展。分子生物學技術(shù)具有快捷、靈敏、準確等優(yōu)點，可精確確定存在于食品中的微生物種類及菌群情況。

1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及相關(guān)技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)是由K. Mullis 建立的一種體外擴增特異DNA 片段的技術(shù)。它利用變性與復性原理，使用DNA 聚合酶，在引物和dNTP 的參與下，在數(shù)小時內(nèi)在體外對特異DNA 片段進行百萬倍擴增[1]。這種技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點。

1.1 多重PCR 技術(shù)

食品中通常含有不止一種致病菌，而普通PCR 技術(shù)僅可對單一致病菌進行定量定性分析，在此技術(shù)基礎(chǔ)上衍生了多重PCR 技術(shù)，通過對引物、溫度等條件的改變，可對兩種或兩種以上致病菌進行同時檢測，是食源性致病菌檢測的重要發(fā)展發(fā)向。Elizaquivel 等運用該技術(shù)對沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行同時檢測[2]。

1.2 RT-PCT

RT—PCT（反轉(zhuǎn)錄PCR），以mRNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄cDNA，然后將此為模板，使用特異性引物，擴增目的序列[3]。該法可在基因表達水平層面上檢測細胞或者組織，還可以檢測細胞中RNA 病毒的含量或直接擴增特定基因的cDNA 等。

1.3 實時定量熒光PCR 技術(shù)

該技術(shù)是將熒光分子加入反應(yīng)體系中，然后通過檢測熒光信號來實時反映DNA 量，可以實時觀測到PCR產(chǎn)物。而多重實時熒光定量PCR 可實現(xiàn)大腸桿菌、沙門菌和金葡球菌的同時、高效共檢。相關(guān)人員利用該方法，對40 份食品樣品中的單增李斯特氏菌進行了檢測，其靈敏度達只需19 個細菌就可以得到陽性結(jié)果[4]。

2 以16S rRNA 為靶基因進行的檢測技術(shù)

16S rRNA存在于所有原核細胞中，有較高的拷貝數(shù)，其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū)，因此可設(shè)計群、屬、種特異性探針進行微生物檢測。對細菌中的16S rRNA 基因進行測序是當前細菌鑒定的“金標準”。馮金牛等人利用該方法對鴨疫里默氏桿菌DNA 進行檢測的最小檢出量為1.907×10—5g/L，菌液的最小檢出量為1.5×104CFU/mL[5]。

3 DNA 指紋圖譜技術(shù)

英國遺傳學家Jefferys 等在1984年將人源小衛(wèi)星DNA 用作基因探針，同人體核DNA 的酶切片段雜交，獲得了長度不等的雜交帶圖紋，因為獲得的圖紋幾乎都不相同，其個體識別能力足以與手指指紋相媲美。目前，隨著科技的發(fā)展，已衍化出多種技術(shù)。

3.1 變性梯度凝膠電泳標記技術(shù)（DGGE 技術(shù)）

DGGE 技術(shù)是在變性劑的作用下從而使DNA 片段電泳遷移率發(fā)生變化，使片段大小相同堿基不同的DNA 片段分開。在食品中微生物的分離、鑒定中使用廣泛，也可以確定生物群落的變化。Ampe 等利用該技術(shù)檢測酸化木薯淀粉發(fā)酵過程中的生物群落，檢測到鏈球菌、乳球菌等微生物[6]。

3.2 溫度梯度凝膠電泳技術(shù)(TGGE技術(shù))

TGGE 技術(shù)是在DGGE 基礎(chǔ)上進一步發(fā)展的技術(shù)，與DGGE 不同的是，該技術(shù)在引物的5’端加入3 050 bp 的GC 片段且有溫度梯度變化[7]。該技術(shù)的特點是可以發(fā)現(xiàn)目前尚未被認識的腸道細菌，但在食品檢驗中的應(yīng)用較少。

3.3 隨即擴增多態(tài)DNA 技術(shù)（RAPD技術(shù)）

RAPD 技術(shù)的特點是引物隨機，擴增后會得到不同大小的DNA，通過分子標記，對不同大小的DNA 進行差異性分析。該技術(shù)以整個細菌DNA 基因組為對象，特異性和敏感性較高，在分子生物學研究甚少的領(lǐng)域或者分子生物學特征不明確或不了解基因組DNA 序列的真菌和乳酸菌的檢測中都可以應(yīng)用該技術(shù)。實際應(yīng)用中在品種純度檢測方面應(yīng)用較多。如余四斌等人利用該技術(shù)快速鑒定雜交水稻種子的純度[8]。

3.4 核糖體RNA 基因分析技術(shù)

現(xiàn)存的所有生物基本都含有核糖體，且rRNA 序列在同種生物細胞中的差異很小，在不同的生物種群中可以通過對比堿基進行分析，相應(yīng)的技術(shù)方法即是核糖體RNA 基因分析技術(shù)，在菌株的分離鑒定中有極大的優(yōu)勢。該技術(shù)可用于副溶血性弧菌、李斯特菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等的檢測[9]。

4 分子印跡技術(shù)

1975 年Southern 首先提出了分子印跡的概念。原理是將一個具有特定形狀和大小的、可識別的分子作為模板分子，將其溶于交聯(lián)劑中，再加入特定的功能單體聚合物后，形成高度交聯(lián)的聚合物，其內(nèi)部包埋有可與功能單體相互作用的模板分子，然后利用物理或化學方法將模板分子洗脫，這樣聚合物母板上留下了與模板分子形狀相似的孔穴，且孔穴內(nèi)各功能基團的位置與所用的模板分子互補，可與模板分子發(fā)生特殊的結(jié)合作用，從而實現(xiàn)對模板分子的識別[10]。近年來，分子印跡技術(shù)運用十分廣泛，無論是DNA、RNA 還是蛋白質(zhì)層面的檢測都可運用該技術(shù)。

4.1 Western blotting

Western blotting 即為蛋白質(zhì)印跡法。它的原理是抗原抗體的特異性結(jié)合。將從待測樣品中提取的分子大小不同的蛋白質(zhì)（抗原）混合物用凝膠電泳法分離后，將其轉(zhuǎn)移到固定支持物上，用帶有標記的抗體做探針與之雜交，通過放射自顯影等技術(shù)檢測基因表達的產(chǎn)物。金明國等人就是利用通過Western blotting 技術(shù)準確檢測馬檳榔甜蛋白[11]。

4.2 Dot blotting

Dot blotting 即為斑點印跡技術(shù)。它是一種酶免疫分析技術(shù)。它的原理是用點滴法或電斑法將抗原轉(zhuǎn)移到尼龍膜上或硝基纖維膜上。該法敏感度極高，毫/微克水平的特異性抗原也可以成功檢出。斑點印跡技術(shù)對實驗室及設(shè)備的要求低，是比較容易掌握的一門技術(shù)。楊靖亞等人利用斑點印跡法技術(shù)特異性檢測致病性副溶血弧菌,靈敏度高、操作簡單，可用肉眼判定結(jié)果[12]。