紫外-可見分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中總?cè)萍岸嗵呛?/h1>
2020-12-03 08:12:52徐曉萍江蘇省理化測試中心
食品安全導(dǎo)刊 2020年30期
□ 朱 莉 徐曉萍 黃 婷 江蘇省理化測試中心
靈芝孢子是靈芝在生長成熟期從靈芝菌褶中彈射出來的卵形生殖細胞，它的主要成分包含三萜類、多糖類、氨基酸多肽類、核苷酸與生物堿類等，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖血脂和增強免疫調(diào)節(jié)等作用[1—3]。靈芝孢子為雙層細胞壁結(jié)構(gòu)，由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，質(zhì)地堅韌，極難氧化分解，因此破壁處理后的靈芝孢子粉更有利于機體對孢內(nèi)有效物質(zhì)的消化吸收[4]?？焖贉y定靈芝孢子粉中所含有效活性成分具有重要意義，本文采用紫外—可見分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中的總?cè)萍岸嗵呛浚y定方法的精密度、重復(fù)性及檢出限進行驗證。
1 材料
1.1 主要試劑
無水乙醇、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、香草醛、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、硫酸銅、無水硫酸鈉統(tǒng)一枸櫞酸鈉；標準品：齊墩果酸（1339），購于NATURE STANDARD 公司；葡聚糖（S14110—100 g，Mw：1×105g/mol），購于上海源葉生物科技有限公司。
1.2 儀器
Cary50 紫外—可見分光光度計（美國瓦里安），EL204 分析天平（上海菁海有限公司），KQ—400KDE 高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MTN—2800W 氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器），SC—3610 低速離心機（安徽中科中佳）。
2 實驗方法
2.1 總?cè)坪繙y定
稱取破壁靈芝孢子粉顆粒約0.2 g，置于100 mL 容量瓶中，加入60 mL無水乙醇，水浴超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）45 min 后，冷卻至室溫后，用無水乙醇定容，搖勻后過濾，吸取過濾液0.20 mL 于10 mL 具塞比色管中，氮吹使溶劑完全揮發(fā)。加入新配置的5%香草醛—冰乙酸溶液0.20 mL 和高氯酸0.80 mL，搖勻。置于70 ℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min。加乙酸乙酯4.00 mL稀釋，搖勻，在546 nm 波長下測定吸光度。
2.2 多糖含量測定
稱取破壁靈芝孢子粉顆粒5.0 g，置于100 mL 圓底燒瓶中，加水80 mL左右，攪拌加熱回流1 h，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，定容至刻度，混勻后過濾。準確吸取過濾液5.0 mL，置于50 mL 離心管中，加入無水乙醇20 mL，混勻5 min 后，以3 000 r/min 離心5 min，棄去上清液。殘渣用80%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3 次，殘渣用水溶解并定容至5.0 mL。準確吸取終溶液2.0 mL，置于50 mL 離心管中，加入100 g/L 氫氧化鈉溶液2.0 mL、銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷卻，以6 000 r/min離心10 min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3 次，殘渣用10%硫酸溶液2.0 mL 溶解洗滌并轉(zhuǎn)移至25 mL 比色管中，加水稀釋至刻度，混勻，準確吸取樣品測定液2.0 mL，置于25 mL比色管中，加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL，在渦旋混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，渦旋混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫，在485 nm 波長下測定吸光度待測。
3 結(jié)果與分析
3.1 波長選擇
分別移取0.50 mL 齊墩果酸對照品溶液（0.20 mg/mL）和2.00 mL 葡聚糖對照品溶液（0.10 mg/mL）至25 mL具塞比色管中，處理顯色后在紫外—可見分光光度計400 ～800 nm 波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)總?cè)圃?46 nm 波長下吸光度最佳，多糖在485 nm 波長下吸光度最佳。
3.2 標準曲線繪制
分別移取齊墩果酸對照品溶液（0.20 mg/mL）0.10、0.20、0.30、0.40 mL和0.50 mL 于25 mL 具塞比色管中，葡聚糖對照品溶液（0.10 mg/mL）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50 mL和2.00 mL 于25 mL 比色管 中，處理顯色后再分別以試劑空白做參比，在546 nm 和485 nm 波長下測定吸光度值，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到總?cè)凭€性回歸方程y=0.262 4x—0.014 3，R2=0.999 7，質(zhì)量濃度范圍0.8 ～4.0 μg/mL；多糖線性回歸 方 程y=0.129 4x—0.013，R2=0.999 9， 質(zhì) 量 濃 度 范 圍0.4 ～8.0 μg/mL。
3.3 精密度試驗
分別移取7 份0.3 mL 齊墩果酸對照品溶液（0.20 mg/mL）和0.6 mL 葡聚糖對照品溶液（0.10 mg/mL），依照方法測定吸光度，計算7 次結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果顯示總?cè)芌SD為1.54%，多糖RSD 為1.99%，表明該方法的精密度良好。
3.4 重復(fù)性試驗
分別平行稱取7 份破壁靈芝孢子粉顆粒0.2 g 用于總?cè)频闹貜?fù)性試驗，5.0 g 用于多糖的重復(fù)性試驗，依照方法測定吸光度，計算7 次結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果顯示總?cè)芌SD為1.91%，多糖RSD 為2.18%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。
3.5 加標回收率
分別取9 份已知含量的供試品，對總?cè)坪投嗵沁M行低、中、高3 種濃度的加標回收率試驗，結(jié)果顯示總?cè)苹厥章蕿?8.0%～95.7%，多糖回收率為93.2%～98.0%，表明該方法的回收率良好。
4 結(jié)論
紫外—可見分光光度法是常見定量方法，因快速、簡單、性價比高，且具有一定的穩(wěn)定性和重復(fù)性，因此在中藥質(zhì)量分析中應(yīng)用較多。本試驗針對線性、檢出限、精密度和回收率等進行方法驗證。結(jié)果表明，總?cè)频馁|(zhì)量濃度在0.8 ～4.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），方法精密度為1.54%，回收率為88.0%～95.7%。多糖的質(zhì)量濃度在0.4 ～8.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的 線性關(guān)系（r=0.999 9），方法精密度為1.99%，回收率為93.2%～98.0%。該方法簡單高效，完全滿足分析方法的要求。
□ 朱 莉 徐曉萍 黃 婷 江蘇省理化測試中心
靈芝孢子是靈芝在生長成熟期從靈芝菌褶中彈射出來的卵形生殖細胞，它的主要成分包含三萜類、多糖類、氨基酸多肽類、核苷酸與生物堿類等，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖血脂和增強免疫調(diào)節(jié)等作用[1—3]。靈芝孢子為雙層細胞壁結(jié)構(gòu)，由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，質(zhì)地堅韌，極難氧化分解，因此破壁處理后的靈芝孢子粉更有利于機體對孢內(nèi)有效物質(zhì)的消化吸收[4]?？焖贉y定靈芝孢子粉中所含有效活性成分具有重要意義，本文采用紫外—可見分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中的總?cè)萍岸嗵呛浚y定方法的精密度、重復(fù)性及檢出限進行驗證。
1 材料
1.1 主要試劑
無水乙醇、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、香草醛、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、硫酸銅、無水硫酸鈉統(tǒng)一枸櫞酸鈉；標準品：齊墩果酸（1339），購于NATURE STANDARD 公司；葡聚糖（S14110—100 g，Mw：1×105g/mol），購于上海源葉生物科技有限公司。
1.2 儀器
Cary50 紫外—可見分光光度計（美國瓦里安），EL204 分析天平（上海菁海有限公司），KQ—400KDE 高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MTN—2800W 氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器），SC—3610 低速離心機（安徽中科中佳）。
2 實驗方法
2.1 總?cè)坪繙y定
稱取破壁靈芝孢子粉顆粒約0.2 g，置于100 mL 容量瓶中，加入60 mL無水乙醇，水浴超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）45 min 后，冷卻至室溫后，用無水乙醇定容，搖勻后過濾，吸取過濾液0.20 mL 于10 mL 具塞比色管中，氮吹使溶劑完全揮發(fā)。加入新配置的5%香草醛—冰乙酸溶液0.20 mL 和高氯酸0.80 mL，搖勻。置于70 ℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min。加乙酸乙酯4.00 mL稀釋，搖勻，在546 nm 波長下測定吸光度。
2.2 多糖含量測定
稱取破壁靈芝孢子粉顆粒5.0 g，置于100 mL 圓底燒瓶中，加水80 mL左右，攪拌加熱回流1 h，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，定容至刻度，混勻后過濾。準確吸取過濾液5.0 mL，置于50 mL 離心管中，加入無水乙醇20 mL，混勻5 min 后，以3 000 r/min 離心5 min，棄去上清液。殘渣用80%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3 次，殘渣用水溶解并定容至5.0 mL。準確吸取終溶液2.0 mL，置于50 mL 離心管中，加入100 g/L 氫氧化鈉溶液2.0 mL、銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷卻，以6 000 r/min離心10 min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3 次，殘渣用10%硫酸溶液2.0 mL 溶解洗滌并轉(zhuǎn)移至25 mL 比色管中，加水稀釋至刻度，混勻，準確吸取樣品測定液2.0 mL，置于25 mL比色管中，加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL，在渦旋混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，渦旋混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫，在485 nm 波長下測定吸光度待測。
3 結(jié)果與分析
3.1 波長選擇
分別移取0.50 mL 齊墩果酸對照品溶液（0.20 mg/mL）和2.00 mL 葡聚糖對照品溶液（0.10 mg/mL）至25 mL具塞比色管中，處理顯色后在紫外—可見分光光度計400 ～800 nm 波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)總?cè)圃?46 nm 波長下吸光度最佳，多糖在485 nm 波長下吸光度最佳。
3.2 標準曲線繪制
分別移取齊墩果酸對照品溶液（0.20 mg/mL）0.10、0.20、0.30、0.40 mL和0.50 mL 于25 mL 具塞比色管中，葡聚糖對照品溶液（0.10 mg/mL）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50 mL和2.00 mL 于25 mL 比色管 中，處理顯色后再分別以試劑空白做參比，在546 nm 和485 nm 波長下測定吸光度值，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到總?cè)凭€性回歸方程y=0.262 4x—0.014 3，R2=0.999 7，質(zhì)量濃度范圍0.8 ～4.0 μg/mL；多糖線性回歸 方 程y=0.129 4x—0.013，R2=0.999 9， 質(zhì) 量 濃 度 范 圍0.4 ～8.0 μg/mL。
3.3 精密度試驗
分別移取7 份0.3 mL 齊墩果酸對照品溶液（0.20 mg/mL）和0.6 mL 葡聚糖對照品溶液（0.10 mg/mL），依照方法測定吸光度，計算7 次結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果顯示總?cè)芌SD為1.54%，多糖RSD 為1.99%，表明該方法的精密度良好。
3.4 重復(fù)性試驗
分別平行稱取7 份破壁靈芝孢子粉顆粒0.2 g 用于總?cè)频闹貜?fù)性試驗，5.0 g 用于多糖的重復(fù)性試驗，依照方法測定吸光度，計算7 次結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果顯示總?cè)芌SD為1.91%，多糖RSD 為2.18%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。
3.5 加標回收率
分別取9 份已知含量的供試品，對總?cè)坪投嗵沁M行低、中、高3 種濃度的加標回收率試驗，結(jié)果顯示總?cè)苹厥章蕿?8.0%～95.7%，多糖回收率為93.2%～98.0%，表明該方法的回收率良好。
4 結(jié)論
紫外—可見分光光度法是常見定量方法，因快速、簡單、性價比高，且具有一定的穩(wěn)定性和重復(fù)性，因此在中藥質(zhì)量分析中應(yīng)用較多。本試驗針對線性、檢出限、精密度和回收率等進行方法驗證。結(jié)果表明，總?cè)频馁|(zhì)量濃度在0.8 ～4.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），方法精密度為1.54%，回收率為88.0%～95.7%。多糖的質(zhì)量濃度在0.4 ～8.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的 線性關(guān)系（r=0.999 9），方法精密度為1.99%，回收率為93.2%～98.0%。該方法簡單高效，完全滿足分析方法的要求。
