陳 曦 黃道梅 孟繁博 鄭秀艷 李國(guó)林

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

克羅諾桿菌(Cronobacterspp.)是包含了熟知的阪崎克羅諾桿菌的一個(gè)新屬，是一種極具污染風(fēng)險(xiǎn)的食源性致病菌，可使新生兒感染壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥、腦膜炎等多種疾病，且死亡率極高[1-2]。克羅諾桿菌屬分布較為廣泛，近些年在五香肉、脫水米粉、調(diào)味品、生蔬、即食食品、嬰兒食品中均發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌的存在，其中嬰兒配方乳粉(powdered infant formula，PIF)已經(jīng)被證實(shí)是該致病菌的主要污染源及傳播媒介，嚴(yán)重威脅新生兒和嬰兒的健康[3-5]。因此，對(duì)市售PIF中克羅諾桿菌的污染情況和特征進(jìn)行分析十分必要。

對(duì)分離自市售PIF的克羅諾桿菌進(jìn)行生化表型分型和基因分型有助于揭示上述來(lái)源的克羅諾桿菌的污染情況和種群特征[6]。張麗麗[7]采用生理生化和分子生物學(xué)鑒定的方法對(duì)市售PIF進(jìn)行了克羅諾桿菌的分離與鑒定，發(fā)現(xiàn)其污染率達(dá)到4.55%。Pan等[8]對(duì)我國(guó)市場(chǎng)中的PIF和較大嬰兒的配方乳粉進(jìn)行克羅諾桿菌污染情況調(diào)查，污染率為10.2%，分離得到的49株克羅諾桿菌被分為了11個(gè)序列型(sequence type，ST)。此外，有研究者對(duì)分離自我國(guó)東北和中原地區(qū)市售PIF中的克羅諾桿菌進(jìn)行了分型分析，發(fā)現(xiàn)分離自上述來(lái)源的克羅諾桿菌主要為阪崎克羅諾桿菌，其中優(yōu)勢(shì)的序列型為ST1、ST4和ST64[9]。上述研究在一定程度上揭示了我國(guó)克羅諾桿菌的種群特征，但有關(guān)貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的污染情況及種群特征的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

抗生素的使用被認(rèn)為是治療克羅諾桿菌感染最常見(jiàn)的方法。研究表明，鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素以及環(huán)丙沙星對(duì)阪崎克羅諾桿菌均有明顯的抗應(yīng)激作用，上述抗生素被認(rèn)為是治療克羅諾桿菌感染的首選[10-11]。但是，長(zhǎng)期使用抗生素或使用不當(dāng)很有可能提高克羅諾桿菌對(duì)抗生素的耐受能力，甚至出現(xiàn)多重耐藥性菌株[12-13]。Kim等[14]從食品中分離得到的克羅諾桿菌對(duì)頭孢洛林和氨芐西林具有耐藥性。Fei等[9]發(fā)現(xiàn)與以往研究相比，分離自中國(guó)市售PIF中的克羅諾桿菌對(duì)氯霉素和慶大霉素的耐藥性有所增加。此外，已有學(xué)者從食品樣品中分離出了對(duì)頭孢噻吩、苯唑西林、青霉素、萬(wàn)古霉素具有抗性的克羅諾桿菌，說(shuō)明目前克羅諾桿菌耐藥性有增加的趨勢(shì)[15-16]。因此，對(duì)食品尤其是嬰兒食品中克羅諾桿菌的耐藥性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)非常有必要。

本研究以貴州省市售的350份PIF樣品為研究對(duì)象，采用國(guó)標(biāo)法和16S rRNA基因測(cè)序法對(duì)其進(jìn)行克羅諾桿菌的分離鑒定，并通過(guò)分離株的生化表型分型、基因分型和抗生素耐藥性分析揭示分離自貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的特征，旨在為貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PIF來(lái)源：350份PIF樣品于2018年1月至2019年1月采集于貴州省各地區(qū)超市，其中覆蓋了5種品牌的PIF，分別標(biāo)記為A、B、C、D和E，每種品牌采集70份樣品。

主要試劑：克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C.sakazakiiATCC 29544T和EscherichiacoliATCC 25922中國(guó)檢科院食品安全微生物菌種保藏管理中心；營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutritious broth)、緩沖蛋白胨水(buffer peptone water)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素(modified lauryl sulfate tryptone broth- vancomycin)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soybean agar)、克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基(chromogenic medium of cronobacter)，青島海博生物有限公司；API 20E生化鑒定試劑盒及輔助試劑，法國(guó)生物梅里埃公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix，美國(guó)Omega公司；藥敏試紙，上海金穗生物科技有限公司；8種抗生素，西寶生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器

DNP-250型大容量恒溫培養(yǎng)箱，常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠；SJ-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)，蘇州艾達(dá)康醫(yī)療科技有限公司；Sartorius Sigma 2-16KL高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)賽多利斯Sartorius集團(tuán)；伯樂(lè)T100梯度PCR儀，濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；Tanon 3500 凝膠圖像分析系統(tǒng)，德國(guó)耶拿儀器股份公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 克羅諾桿菌的分離鑒定 以《GB 4789.40-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗(yàn)》[17]的方法為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PIF樣品中的克羅諾桿菌進(jìn)行分離鑒定；隨后再對(duì)分離的菌株進(jìn)行基于16S rRNA的分子鑒定。

1.3.2 API 20E表型分型 參照Nazarowec-white等[18]的報(bào)道采用API 20E的方法對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行生化分型，以C.sakazakiiATCC 29544T的表型特征定義為生物表型1，其余分離菌株與其反應(yīng)模式比較，刪除相同的生化反應(yīng)，保留具有差異的生化反應(yīng)項(xiàng)目，把每種區(qū)別于生物表型1的生化特征定義為另外一種新的生物表型，從而確定克羅諾桿菌的表型分型結(jié)果。

1.3.3 多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)分析 參照Baldwin等[19]的報(bào)道，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司完成引物(atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA)的合成。以克羅諾桿菌DNA為模板，PCR反應(yīng)體系(50 μL)：模板DNA 2.0 μL、2× buffer 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL。擴(kuò)增條件參照Baldwin等[19]的報(bào)道。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，并完成基因測(cè)序。將測(cè)序獲得的持家基因序列在克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubmlst.org/cronobacter/)中進(jìn)行比對(duì)，獲得克羅諾桿菌的等位基因編碼，根據(jù)對(duì)應(yīng)的等位基因編碼最終確定分離菌株的序列型。

1.3.4 分子分型及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 從GenBank中下載克羅諾菌屬及腸桿菌屬的相關(guān)菌種標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列作為參考序列，同測(cè)序獲得的分離菌株的16S rRNA序列共同進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。之后，將菌株7個(gè)持家基因序列串聯(lián)得到長(zhǎng)度為3 036 bp的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用Mega 6.0軟件，選擇最大似然算法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，同時(shí)查找并下載克羅諾桿菌屬7個(gè)種標(biāo)準(zhǔn)菌株所對(duì)應(yīng)的串聯(lián)序列，將其作為參考菌株序列，構(gòu)建最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.3.5 克羅諾桿菌的耐藥性分析 選取八類常見(jiàn)的8種抗生素，分別為慶大霉素、磺胺、頭孢噻肟、萬(wàn)古霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、氯霉素，以EscherichiacoliATCC 25922作為質(zhì)控菌株，利用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散試驗(yàn)法分析克羅諾桿菌對(duì)上述抗生素的耐藥性[21]。將菌懸液稀釋為0.5(以麥克法蘭標(biāo)準(zhǔn)計(jì))，按照藥敏紙片的說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI-M100-S19)[22]對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。

2 結(jié)果與分析

2.1 克羅諾桿菌的污染情況

以國(guó)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，利用16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行基因?qū)用娴蔫b定，結(jié)果如表1所示。鑒定結(jié)果均表明22株可疑菌株除S4為陰溝腸桿菌，其余菌株均鑒定為克羅諾桿菌，貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的檢出率為6%。此外，16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示以99%為閾值，21株克羅諾桿菌中有18株為阪崎克羅諾桿菌，另外3株克羅諾桿菌與阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌的相似性均高達(dá)98%以上。進(jìn)一步分析不同品牌PIF中克羅諾桿菌的污染情況，結(jié)果如圖1所示，5種不同品牌PIF中，C品牌的污染率最高，為8.57%，A品牌的污染率最低，為4.28%。

表1 API 20E及16S rRNA鑒定結(jié)果Table 1 API 20E and 16S rRNA appraisal results

2.2 克羅諾桿菌的表型分型

利用API 20E生化鑒定的菌株共計(jì)22株(包括C.sakazakiiATCC 29544T)，菌株S4鑒定結(jié)果為陰溝腸桿菌，故不參與表型分型分析。API 20E生化試驗(yàn)結(jié)果顯示(表2)，分離菌株在利用21項(xiàng)生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定時(shí)，僅對(duì)精氨酸、鳥氨酸、脲酶、肌醇、山梨醇5種反應(yīng)底物以及VP試驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)差異。按照Nazarowec-white的表型分型方法對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行表型分型，結(jié)果表明，22株克羅諾桿菌分為6種生物表型，其中生物表型1所占權(quán)重最高(占45.4%)，是分離菌株的主要表型。

圖1 不同品牌PIF中克羅諾桿菌的污染率Fig.1 Contamination rates of Cronobacter spp. in different brands of PIF

表2 克羅諾桿菌表型分型結(jié)果Table 2 Results of phenotypic typing of Cronobacter spp.

2.3 克羅諾桿菌的分子分型

2.3.1 16S rRNA分型 利用MEGA 6.0軟件對(duì)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖2所示，所有菌株分成兩個(gè)類群，21株分離菌株與克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株位于同一類群GroupⅠ，親緣關(guān)系較近，而與菌株S4所在的陰溝腸桿菌GroupⅡ的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與16S rRNA測(cè)定鑒定的結(jié)果一致。其中21株分離菌株進(jìn)一步分為3個(gè)類群，所在同一類群的菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近。

圖2 基于16S rRNA 序列的最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Minimum likelihood phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences

2.3.2 MLST分析 利用MLST技術(shù)確定菌株的序列型，結(jié)果如表3所示，21株克羅諾桿菌分為11個(gè)序列型，分別為ST193(7株)、ST157(3株)、ST189(2株)、ST208(2株)、ST37(1株)、ST212(1株)、ST336(1株，丙二酸鹽克羅諾桿菌)、ST4(1株)、ST142(1株)、ST17(1株)和ST23(1株)，表明分離自貴州省市售PIF的克羅諾桿菌具有較高的遺傳多樣性。其中，ST193和ST157的克羅諾桿菌菌株數(shù)量分別占總菌株數(shù)的33.3%和14.3%，為該地區(qū)市售PIF中克羅諾桿菌的優(yōu)勢(shì)序列型。

在此基礎(chǔ)上對(duì)上述菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖3所示，所有菌株分為兩大類群，除菌株S3外，20株分離菌株與阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株同位于Group Ⅰ，同時(shí)Group Ⅰ進(jìn)一步劃分為3個(gè)簇，歸屬同一簇中的菌株遺傳信息相似，親緣關(guān)系較近。Group Ⅱ包括2個(gè)簇，其中菌株S3與C.malonaticusLMG 23826同位于GroupⅡ1，從而進(jìn)一步將菌株S3歸屬于丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌物種。此外，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果可知，分離株的親緣關(guān)系與其來(lái)源(不同品牌)無(wú)明顯內(nèi)在聯(lián)系。

2.4 克羅諾桿菌的耐藥性分析

由表4可知，21株克羅諾桿菌對(duì)四環(huán)素和萬(wàn)古霉素耐藥性較高，分別為80.1%和90.5%；而對(duì)氨芐西林、慶大霉素和氯霉素最為敏感，敏感率均達(dá)到95.2%，其次為環(huán)丙沙星(76.2%)、頭孢噻肟(71.4%)和磺胺(66.7%)。

3 討論

克羅諾桿菌是PIF中的A類致病菌，嚴(yán)重危害著新生兒的健康，因此，對(duì)該致病菌的檢測(cè)一直是研究重點(diǎn)。O’Brien等[23]調(diào)查了歐洲的PIF和嬰兒飲品克羅諾桿菌的污染情況，發(fā)現(xiàn)PIF中該致病菌的污染率為0，主要的污染存在于以谷物為主的嬰兒飲品中。Santos等[24]從42個(gè)來(lái)自巴西的PIF樣品中分離出12株克羅諾桿菌，污染率高達(dá)29%。Fatimah等[25]則發(fā)現(xiàn)埃及境內(nèi)PIF中克羅諾桿菌的污染率為5.2%。Fei等[9, 26]于2015年和2018年對(duì)我國(guó)市售PIF進(jìn)行了克羅諾桿菌檢測(cè)，污染率分別為3.5%和2.8%。本研究中，貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的總污染率為6%，對(duì)嬰幼兒的健康存在潛在的危害，應(yīng)給予一定的重視。此外，在5種品牌中，C品牌的污染率最高，為8.57%，A品牌的污染率最低，為4.28%。此外，ST193是A、C和D品牌中克羅諾桿菌的優(yōu)勢(shì)序列型，在B品牌中未被發(fā)現(xiàn)，而ST189是B品牌中克羅諾桿菌的優(yōu)勢(shì)序列型。

對(duì)PIF中克羅諾桿菌進(jìn)行生化表型分型和遺傳多樣性分析有助于了解該種群，以便制定針對(duì)性的防控措施[24]。API 20E生化鑒定是基于20種生化反

表3 克羅諾桿菌MLST分析結(jié)果Table 3 Results of MLST analysis of Cronobacter spp.

應(yīng)對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定和生化分型，這種方法存在一定的假陽(yáng)性[27]。16S rRNA基因測(cè)序可以從基因?qū)用鎸?duì)克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)菌株進(jìn)行基因分型，但這種方法的辨識(shí)度不高，無(wú)法將遺傳相似性較高的C.sakazakii與C.malonaticus區(qū)分開[9]。MLST分析由于其較高的辨識(shí)度和可共享性，已被普遍應(yīng)用于細(xì)菌的分子分型。利用上述3種方法對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行分型可以起到互補(bǔ)作用，一種菌株可以同時(shí)具有3種型別，組合在一起可進(jìn)一步區(qū)分菌種的多態(tài)性。因此，本研究選取上述3種方法對(duì)分離株進(jìn)行生化表型和基因分型，可以得到更全面的數(shù)據(jù)，從而提高對(duì)貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的認(rèn)識(shí)。

本研究中，21株克羅諾桿菌中，20株為阪崎克羅諾桿菌，1株為丙二酸鹽克羅諾桿菌，說(shuō)明分離自貴州省市售PIF的克羅諾桿菌的優(yōu)勢(shì)種為阪崎克羅諾桿菌，這與Fei等[9]和Joseph等[20]的報(bào)道一致。此外，將21株克羅諾桿菌分為11個(gè)序列型，其中ST193和ST157是主要的序列型。不同的是，在歐洲和新西蘭等地，ST1、ST40、ST9和 ST3是分離自PIF及其加工環(huán)境中克羅諾桿菌的優(yōu)勢(shì)序列型[28]。Muller等[29]發(fā)現(xiàn)ST83是瑞士PIF及生產(chǎn)環(huán)境中克羅諾桿菌的優(yōu)勢(shì)序列型。Fei等[9]對(duì)分離自我國(guó)東北和中原地區(qū)市售PIF中的克羅諾桿菌進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)ST1、ST4和ST64為優(yōu)勢(shì)序列型。上述研究說(shuō)明，分離自不同地區(qū)的克羅諾桿菌的優(yōu)勢(shì)序列型不同，這可能與PIF產(chǎn)品產(chǎn)地或銷售地的環(huán)境有關(guān)，因此有必要對(duì)特定地區(qū)PIF中的克羅諾桿菌進(jìn)行遺傳多樣性研究，從而提供有針對(duì)性的防控依據(jù)。

表4 21株克羅諾桿菌耐藥性分析Table 4 Antibiotic susceptibility of 21 Cronobacter strains

圖3 7個(gè)持家基因串聯(lián)序列(3 036 bp)的最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Maximum-likelihood tree of the spliced sequences of the 7 house keeping genes (3 036 bp)

研究表明，早期分離自食品的克羅諾桿菌很少受到外界抗生素的作用，其對(duì)大多數(shù)的抗生素都非常敏感，因此，抗生素被認(rèn)為是最有效的治療人體克羅諾桿菌感染的方法[10]。但是隨著抗生素的長(zhǎng)時(shí)間使用，或者不科學(xué)的濫用，受試菌株可能會(huì)發(fā)生突變或者基因水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致耐藥性增加[27, 30]。已有研究表明，由于臨床長(zhǎng)期的使用，分離自醫(yī)院臨床環(huán)境中的克羅諾桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、阿卡米星、頭孢他啶和亞胺培南呈現(xiàn)不同程度的抗生素耐藥性[31-32]。此外，由于克羅諾桿菌有較強(qiáng)的產(chǎn)生生物膜的能力，使得其能夠長(zhǎng)時(shí)間粘附在PIF生產(chǎn)設(shè)備表面，并起到減少抗生素對(duì)菌體破壞的作用，因此，生物膜對(duì)克羅諾桿菌的保護(hù)作用為其產(chǎn)生耐藥性創(chuàng)造了條件[33]。Fei等[9]研究發(fā)現(xiàn)，分離自我國(guó)市售PIF中的克羅諾桿菌對(duì)四環(huán)素和頭孢噻肟的耐藥性均為0，而在本研究中，分離自貴州省市售PIF中的克羅諾桿菌對(duì)四環(huán)素和頭孢噻肟的耐藥性為81.0%和14.3%，說(shuō)明本研究中的受試菌株對(duì)四環(huán)素和頭孢噻肟的耐受性有所提高。因此，很有必要對(duì)PIF中克羅諾桿菌耐藥性進(jìn)行持續(xù)的監(jiān)控。

4 結(jié)論

本研究調(diào)查了貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的污染情況，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)PIF克羅諾桿菌的總污染率為6%，對(duì)嬰幼兒的健康具有潛在的威脅。利用API 20E生化鑒定系統(tǒng)、16S rRAN基因測(cè)序和MLST分析揭示了分離株的生化分型和基因多樣性，共分離得到21株克羅諾桿菌，其中20株為阪崎克羅諾桿菌，1株為丙二酸鹽克羅諾桿菌，分為6個(gè)生化表型，3個(gè)類群和11個(gè)序列型，其中ST193和ST157為優(yōu)勢(shì)序列型?？股啬褪苄栽囼?yàn)表明，分離自貴州省市售PIF中的克羅諾桿菌對(duì)四環(huán)素和頭胞噻肟的耐受性有所提高。本研究結(jié)果有助于揭示貴州省市售PIF中克羅諾桿菌的污染情況和種群特征，并為該致病菌的針對(duì)性防控和治療提供了有力的科學(xué)依據(jù)。