符楊磊 魏志園 王 宇 劉瀟陽 王冰冰 喬亞科 李桂蘭 張 鍇,*

(1河北科技師范學院農(nóng)學與生物科技學院，河北 秦皇島 066000；2河北科技師范學院園藝科技學院，河北 秦皇島 066000)

鹽堿地是遍布全球的一種土壤類型，具有較大的潛在利用價值。我國有近4 000萬hm2鹽堿荒地和200萬hm2沿海灘涂，尤其是冀東濱海地區(qū)鹽堿地分布廣泛。冀東地區(qū)鹽漬化土壤呈沿海帶狀縱深分布，pH值最高達8.0，土壤pH值高于7.5的土地面積達34%[1]。土壤鹽堿化會導致土粒高度分散或板結，滲水性失調(diào)，嚴重影響植物在土壤中扎根生長。由于缺少耐鹽堿作物品種，不適合傳統(tǒng)作物生長的鹽堿地得不到充分利用，因此，篩選耐鹽堿作物種質(zhì)資源是充分利用鹽堿地資源，解決日益增長的糧食需要與耕地面積不足之間矛盾的重要途徑之一。我國是大豆的起源地，保存有豐富的野生大豆(Glycinesoja)資源。野生大豆資源中蘊含豐富的抗性基因，與耐鹽堿相關的基因可參與調(diào)控植株鹽堿脅迫反應[2-4]，增強耐鹽堿能力，且已通過轉(zhuǎn)基因驗證[5-6]。野生大豆中的抗性基因可用于拓寬栽培大豆的遺傳基礎，培育抗性栽培大豆新品種。

鹽堿脅迫對植物的傷害主要表現(xiàn)在滲透脅迫、離子毒害[7]和高pH值損傷，脅迫下植物細胞內(nèi)Na+濃度升高，造成脂質(zhì)過氧化，并伴隨著電解質(zhì)的外滲[8-9]。丙二醛(malondialdehyde, MDA)是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量反映了質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化水平；電解質(zhì)外滲率是判斷電解質(zhì)外滲水平的指標，反映了細胞在脅迫狀態(tài)下的損傷程度；可溶性糖和脯氨酸可以調(diào)節(jié)細胞滲透壓，在鹽堿、干旱等脅迫下脯氨酸及可溶性糖含量有升高的趨勢[10-12]。植株體內(nèi)脯氨酸合成關鍵酶吡咯琳-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)、吡咯琳-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)及介導脯氨酸降解的脯氨酸脫氫酶(proline dehydrogenase，PDH)對脅迫下植株脯氨酸含量具有重要調(diào)節(jié)作用[13-14]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，P5CS基因可由干旱、鹽脅迫和植物激素脫落酸(abscisic acid, ABA)誘導[15]。過表達P5CS的轉(zhuǎn)基因煙草植株中脯氨酸含量升高，對滲透脅迫耐性增強[16]。因此，P5CS和P5CR對植物脯氨酸的生物合成及維持細胞滲透平衡具有重要意義[17]。此外，王臻昱等[18]對野生大豆GsGST19基因功能進行研究，發(fā)現(xiàn)過表達GsGST19基因的苜蓿耐鹽堿能力提高。鑒于脯氨酸代謝酶基因及GSTs基因在植物耐鹽堿脅迫中的作用，本研究選取GmP5CS、GmP5CR、GmPDH和GsGST19基因以研究不同耐性野生大豆材料在鹽堿脅迫下基因的表達情況。

本研究對349份野生大豆種質(zhì)資源進行抗鹽堿性鑒定，對不同耐性野生大豆種質(zhì)在鹽堿脅迫下的脯氨酸、MDA、可溶性糖含量，電解質(zhì)外滲率及GmP5CS、GmP5CR、GmPDH和GsGST19基因的表達進行測定，旨在篩選高耐鹽堿的野生大豆材料，為野生大豆抗鹽堿資源利用、抗性機理研究和培育優(yōu)質(zhì)抗性大豆新品種提供育種材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生大豆材料共349份，由河北科技師范學院野生大豆資源課題組提供。

1.2 試驗設計

野生大豆籽粒利用小刀破泥漿膜后播種于直徑10 cm的營養(yǎng)缽內(nèi)。缽中培養(yǎng)介質(zhì)以營養(yǎng)土和蛭石按等體積配置。每缽播種3粒野生大豆，每個野生大豆材料種植9缽，置于溫室中生長。溫室溫度25℃/15℃，每天日照時長14 h。待幼苗第一對真葉完全展開后進行鹽堿液處理，鹽堿液按NaCl∶Na2CO3(無水)=1∶3質(zhì)量分數(shù)配置(調(diào)pH值至8.0)。鹽堿液濃度為0(CK)、100和200 mmol·L-1，每種濃度處理3缽。每隔3 d澆一次鹽堿液，每次150 mL，共澆3次。最后一次處理3 d后用清水進行透灌。設置3次生物學重復。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 野生大豆耐鹽堿性等級調(diào)查 清水透灌3 d后，按照羅教芬[19]的方法進行耐鹽堿性等級調(diào)查。具體分為5等級：1級(高耐)：植株未表現(xiàn)受害癥狀，生長與CK無差異；2級：植株生長基本正常，個別植株下部有萎蔫癥狀；3級：植株受害癥狀(主要為葉片表現(xiàn)枯萎癥狀)達整個植株三分之一；4級：植株受害癥狀達整個植株二分之一；5級：植株受害癥狀在整個植株二分之一以上，甚至死亡。

每個野生大豆材料調(diào)查9株，鹽堿性等級取9株中受害等級最高者。本試驗選取高耐材料1份、敏感材料2份進行后續(xù)指標的測定。

1.3.2 脯氨酸含量測定 由于鹽堿脅迫下植物脯氨酸含量有升高趨勢[10, 12]，故測定了鹽堿脅迫下野生大豆材料脯氨酸含量。于鹽堿脅迫處理0(處理后立即取樣)、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株葉片加入3 mL 3%磺基水楊酸溶液，煮沸10 min，過濾，濾液加入2 mL冰醋酸和2 mL 2.5%酸性茚三酮溶液，沸水煮沸30 min。溶液冷卻后加入4 mL甲苯，充分搖蕩混勻，靜置分層后用移液槍吸取上層液至新的10 mL離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，上清液利用UV1901PC型紫外分光光度計(上海奧析公司)于520 nm波長處讀取吸光度值。

1.3.3 MDA含量測定 分別于鹽堿脅迫處理0、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株葉片，加入2 mL 5%三氯乙酸溶液，研磨后3 000 r·min-1離心10 min。吸取1 mL上清液至新的離心管中，加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，充分混勻后沸水煮沸30 min，3 000 r·min-1離心10 min，上清液分別于450、532和600 nm波長處測定吸光度值。

1.3.4 可溶性糖含量測定 分別于鹽堿脅迫處理0、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株葉片，加入10 mL蒸餾水，沸水煮沸20 min，冷卻至室溫后定容至100 mL。取1 mL定容液加入5 mL 0.2%蒽酮溶液，于620 nm波長處測定吸光度值。

1.3.5 電解質(zhì)外滲率測定 分別于鹽堿脅迫處理0、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株葉片材料于離心管中，加入10 mL去離子水，將離心管放入真空干燥機中用真空泵抽氣10 min，抽氣后緩緩打開閥門，將離心管取出后于室溫放置24 h，期間多次晃動，促進水分交換，利用DDS-307電導儀(上海儀分科學儀器有限公司)測定其電導值，作為初值(K1)，以去離子水為空白對照組。測完初值的離心管放入沸水中煮沸10 min，以殺死細胞組織，待其冷卻至室溫后，搖勻，測其電導值，作為終值(K2)。根據(jù)公式計算電解質(zhì)外滲率：

電解質(zhì)外滲率=K1/K2×100%

(1)。

1.3.6 耐鹽堿相關基因表達測定 分別于鹽堿脅迫處理0、3、10、24、48 h后取野生大豆材料植株葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。以cDNA為模板，β-Tubulin為內(nèi)參基因進行耐鹽堿相關基因表達量測定。GmP5CS、GmP5CR和GmPDH基因序列通過NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取，其GenBank登錄號分別為AY492005 547907和NM_001250359，GsGST19(JQ031560)基因序列通過王臻昱等[18]研究報告獲取。利用Primer Premier 5.0軟件設計基因全長序列的定量PCR引物(表1)。利用CFX96型熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)進行定量PCR測定，試劑盒采用One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SAS 9.2和Microsoft Excel 2003進行統(tǒng)計，利用Duncan’s多重比較法進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 冀東野生大豆耐鹽堿鑒定結果

349份野生大豆進行耐鹽性鑒定結果如表2所示。由于200 mmol·L-1鹽堿液處理野生大豆后全部植株的耐鹽堿等級均表現(xiàn)為5級，故本研究結果為100 mmol·L-1鹽堿液處理后野生大豆的耐鹽堿性等級。表現(xiàn)1級的高耐材料有Yong 2和2010-12，占總數(shù)的0.57%；表現(xiàn)2級的耐性材料有22份，占總數(shù)的6.30%；表現(xiàn)3級的材料共80份，占總數(shù)的22.92%；表現(xiàn)4級的材料共77份，占總數(shù)的22.06%，表現(xiàn)5級的材料共161份，占總數(shù)的46.13%。冀東地區(qū)野生大豆材料對鹽堿脅迫表現(xiàn)3級及以上的占總數(shù)的91.11%，表明這些野生大豆材料對本試驗中所用鹽堿處理水平的耐性較差。篩選到野生大豆材料Yong 2和2010-12對鹽堿脅迫耐性好，可作為耐鹽堿相關研究的種質(zhì)材料。

表2 野生大豆耐鹽堿鑒定結果Table 2 Results of salt and alkali tolerance of wild soybean

表2(續(xù))

2.2 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料的脯氨酸含量

高耐野生大豆材料2010-12和敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在100與200 mmol·L-1鹽堿液脅迫下脯氨酸含量測定結果如圖1所示。高耐野生大豆材料2010-12在鹽堿脅迫處理后脯氨酸含量在各脅迫時間點均較CK顯著升高，并且100與200 mmol·L-1的鹽堿液處理間無顯著差異。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49脯氨酸含量在2種濃度的鹽堿液脅迫處理下隨著脅迫時間的延長與CK均無顯著差異。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note： Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 不同野生大豆材料在鹽堿脅迫下的脯氨酸含量Fig.1 Proline content in different wild soybean materials under saline-alkali stress

圖2 鹽堿脅迫下不同野生大豆材料MDA含量Fig.2 MDA content in different wild soybean materials under saline-alkali stress

2.3 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料MDA含量

由圖2可知，高耐野生大豆材料2010-12在100與200 mmol·L-1鹽堿液處理下MDA含量在各脅迫時間點與CK相比均無顯著差異。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在鹽堿脅迫處理后各脅迫時間點MDA含量均較CK顯著升高，2種濃度鹽堿脅迫處理間無顯著差異。

2.4 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料可溶性糖含量

由圖3可知，高耐野生大豆材料2010-12在100與200 mmol·L-1的鹽堿脅迫后可溶性糖含量均較CK顯著升高，但2種濃度鹽堿液處理間無顯著差異。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在2種濃度的鹽堿液脅迫處理下各脅迫時間點與CK均無顯著差異。

圖3 鹽堿脅迫下不同野生大豆材料可溶性糖含量Fig.3 Soluble sugar content in different wild soybean materials under saline-alkali stress

2.5 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料電解質(zhì)外滲率

鹽堿脅迫下3份野生大豆植株電解質(zhì)外滲率的測定結果如圖4所示。100與200 mmol·L-1鹽堿液脅迫下，高耐野生大豆材料2010-12在各脅迫時間點電解質(zhì)外滲率與CK相比均無顯著差異。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在2種濃度鹽堿液處理下各脅迫時間點均較CK顯著升高，且2種濃度鹽堿液處理間無顯著差異。

圖4 鹽堿脅迫下不同野生大豆材料電解質(zhì)外滲率Fig.4 Electrolyte exosmosis rate in different wild soybean materials under saline-alkali stress

2.6 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料基因表達結果

鹽堿脅迫下野生大豆材料耐鹽堿相關基因表達情況如圖5所示，高耐鹽堿野生大豆材料2010-12在2種濃度鹽堿脅迫后GmP5CS、GmP5CR和GsGST19的表達量均升高，在各脅迫時間點與CK相比均達到差異顯著水平；GmPDH的表達量降低，在各脅迫時間點與CK相比均達到差異顯著水平。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在2種濃度鹽堿脅迫后4個基因的表達量與CK相比均無顯著差異。

3 討論

野生大豆中的優(yōu)異基因是栽培大豆優(yōu)異基因的重要來源，對于拓寬栽培大豆遺傳多樣性十分重要。目前已發(fā)現(xiàn)一些高耐鹽堿的野生大豆種質(zhì)資源。葛瑛等[20]對采集于吉林省白城市的345份野生大豆材料進行耐鹽堿性鑒定，篩選得到9份耐鹽堿性較強的野生大豆材料；肖鑫輝等[21]對津唐渤海灣沿海地區(qū)的895份野生大豆材料進行高濃度鹽堿脅迫，發(fā)現(xiàn)只有8.5%的材料活到了成熟期，最終篩選出15份耐鹽堿較好的野生大豆種質(zhì)。這些研究表明自然界中存在高耐鹽堿的野生大豆種質(zhì)資源。本研究利用采集于冀東地區(qū)的349份野生大豆種質(zhì)進行耐鹽堿性鑒定，處理的鹽堿液濃度為100 和200 mmol·L-1，比一般研究所用鹽堿脅迫濃度高，目的是在高濃度鹽堿脅迫下篩選極端耐鹽堿的野生大豆種質(zhì)資源。研究發(fā)現(xiàn)耐性等級為3、4、5的野生大豆材料占絕大多數(shù)(93.13%)，可能與鹽堿脅迫處理的濃度較高有關；耐性等級1級和2級的野生大豆種質(zhì)共24份(6.87%)，可作為優(yōu)異種質(zhì)培育耐鹽堿栽培大豆。

Yu等[22]發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫下，菜豆(Phaseolusvulgaris)植株體內(nèi)可溶性糖和脯氨酸含量升高，這對保持細胞離子平衡，維持細胞pH值有一定作用。此外，Jiao等[23]研究發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫下，高耐野生大豆材料體內(nèi)的脯氨酸合成通路較敏感材料顯著激活，符楊磊[24]發(fā)現(xiàn)野生大豆脯氨酸含量在鹽堿脅迫48 h后較對照顯著增加。本研究對鹽堿脅迫下不同耐性水平野生大豆植株體內(nèi)MDA、脯氨酸、可溶性糖含量和電解質(zhì)外滲率進行測定，結果與前人相似。高耐鹽堿野生大豆2010-12在鹽堿脅迫下植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量較CK顯著升高，MDA含量與電解質(zhì)外滲率與CK無顯著差異。說明高耐材料在鹽堿脅迫下電解質(zhì)外滲率低，能夠維持較穩(wěn)定的離子平衡，與其脯氨酸及可溶性糖含量升高有關。脯氨酸和可溶性糖對植物細胞滲透調(diào)節(jié)十分重要[25]，多種植物在鹽堿脅迫下脯氨酸和可溶性糖含量均呈升高趨勢[26-29]。但也有研究表明，脯氨酸含量升高與植株的耐鹽堿性無相關性，其含量升高只是植株在逆境下的一種被動反應。如Chen等[30]發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫下，耐鹽大麥(Hordeumvulgare)材料植株脯氨酸含量與對照無顯著差異，而Lacerda等[31]發(fā)現(xiàn)感性高粱(Sorghumbicolor)材料植株體內(nèi)積累了更多的脯氨酸，此外Lv等[32]發(fā)現(xiàn)水稻(Oryzasativa)在鹽堿脅迫下全部材料體內(nèi)脯氨酸含量均升高。綜上所述，植物在鹽堿脅迫下脯氨酸積累量與其耐性水平的相關性需進一步研究。

在滲透脅迫下，P5CS和P5CR是脯氨酸合成的關鍵酶，滲透脅迫解除后，PDH對植物脯氨酸含量恢復至正常狀態(tài)十分重要[33]。如Tavakoli等[34]和Lv等[35]分別對小麥(Triticumaestivum)和水稻進行了相關研究，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫處理下，小麥植株體內(nèi)P5CS和P5CR上調(diào)表達、PDH下調(diào)表達，脯氨酸含量升高[34]，水稻植株體內(nèi)脯氨酸合成基因(OsP5CS1，OsP5CS2和OsP5CR)以及降解酶基因(OsPDH1)的表達量顯著上調(diào)，脯氨酸含量升高[35]。本研究測定了脯氨酸合成相關基因GmP5CS、GmP5CR以及降解相關基因GmPDH的表達量，結果與前人相似。在鹽堿脅迫下，高耐野生大豆材料2010-12中GmP5CS和GmP5CR上調(diào)表達，GmPDH下調(diào)表達，而在敏感野生大豆材料2012-34和2012-49中GmP5CS、GmP5CR及GmPDH的表達量與CK無顯著差異。以上結果說明，鹽堿脅迫下高耐野生大豆材料脯氨酸合成通路激活，結合其細胞內(nèi)脯氨酸含量升高，表明在鹽堿脅迫下，高耐野生大豆材料脯氨酸的上調(diào)可能與其抗性較高有關。

4 結論

本研究對采集于冀東地區(qū)的349份野生大豆材料進行耐鹽堿性鑒定，發(fā)現(xiàn)Yong 2和2010-12等野生大豆材料對鹽堿脅迫耐性較高，為培育耐鹽堿栽培大豆提供了種質(zhì)資源。另外，在鹽堿脅迫下，高耐鹽堿野生大豆GsGST19表達量顯著升高，說明GsGST19基因在植株鹽堿脅迫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了重要作用，這對GSTs基因功能研究具有重要意義。此外，高耐鹽堿野生大豆材料脯氨酸及可溶性糖含量顯著升高，丙二醛含量及電解質(zhì)外滲率無顯著變化，脯氨酸合成關鍵酶基因GmP5CS和GmP5CR上調(diào)表達，降解關鍵酶基因GmPDH下調(diào)表達，說明鹽堿脅迫下高耐鹽堿野生大豆脯氨酸合成通路激活，脯氨酸積累量升高，這對野生大豆抵抗鹽堿脅迫十分重要。