陳 琳 黃定貴 伍朝春 劉景慧 肖和衛(wèi) 魏亞楠 李林茂

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院體檢中心，南寧市 530021，電子郵箱：15007718280@139.com)

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高，目前已成為全球第四大致命性腫瘤[1-2]，嚴重危害人體健康。多藥耐藥是指癌細胞對某種化療藥產(chǎn)生耐藥性后，對未接觸的、結構及功能不同的多種抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象[3]。多藥耐藥是阻礙癌癥化療實施、影響化療效果的重要因素[4]。中西醫(yī)聯(lián)合治療可明顯改善多種腫瘤的臨床緩解率與生存期。黃連素屬于異喹啉生物堿，具有抗腫瘤作用，毒副作用低。研究顯示，黃連素可誘導腫瘤細胞凋亡、抑制環(huán)氧化酶-2表達[5]，還可調(diào)節(jié)多重耐藥載體P-糖蛋白的表達[6]，這表明黃連素在多藥耐藥機制中發(fā)揮了重要的作用。本研究觀察黃連素對耐奧沙利鉑(oxaliplatin,OXA)人結腸癌細胞株耐藥性的影響，為結腸癌的治療提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源：人結腸癌細胞株THC-8307(批號：WG101808)及耐OXA結腸癌細胞株THC-8307/OXA(批號：WG102808)均購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 主要藥物與試劑：細胞培養(yǎng)用胎牛血清(批號：16140071)、高糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM;批號：11965-092)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie acid,EDTA)(批號：15050065)均購自美國Thermo Fisher公司，OXA(批號：61825-94-3)和黃連素(批號：S583634)均購自美國Sigma公司，噻唑藍試劑盒(批號：M1020)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO；貨號：D8371)均購自北京Solarbio公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：THC-8307細胞和THC-8307/OXA細胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)，THC-8307/OXA細胞培養(yǎng)時添加2.5 μg/mL OXA維持其耐藥性。

1.2.2 分組及干預方法：取對數(shù)生長期的THC-8307和THC-8307/OXA細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，按分組進行干預。(1)THC-8307細胞和THC-8307/OXA細胞均分為空白對照組、黃連素5 μg/mL組、黃連素10 μg/mL組、黃連素20 μg/mL組進行實驗，除空白對照組(不加入任何藥物)外，其他組加入相應濃度的黃連素進行干預。每組設置3個復孔，干預培養(yǎng)時間48 h。(2)THC-8307細胞和THC-8307/OXA細胞均分為OXA對照組、黃連素5 μg/mL+OXA組、黃連素10 μg/mL+OXA組、黃連素20 μg/mL+OXA組進行實驗，給予相應的藥物進行干預，其中使用20 μg/mL OXA進行干預。每組設置3個復孔，干預培養(yǎng)時間48 h。

1.2.3 噻唑藍比色法測定：干預結束后，吸棄上清，加入90 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，再加入10 μL 噻唑藍溶液，培養(yǎng)4 h。然后吸棄上清，加入110 μL DMSO溶液，置搖床上低速震蕩10 min，使結晶充分溶解，使用FilterMax F3酶標儀(美國MD)于490 nm參數(shù)測量各孔吸光值(A值)，結果取均值。按照公式計算細胞存活率及抑制率，細胞存活率=[(給藥組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)]×100%，抑制率=(1-細胞存活率)×100%。使用SPSS 25.0軟件中Probit模型分析計算半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration,IC50)，其中逆轉倍數(shù)=OXA組IC50/黃連素+OXA組IC50。每組實驗重復5次，結果以(x±s)表示。

1.2.4 細胞形態(tài)學的觀察：使用日本尼康公司Ti2倒置相差顯微鏡進行細胞形態(tài)學觀察，使用電荷耦合裝置圖像采集系統(tǒng)進行圖片采集。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 黃連素對THC-8307細胞和THC-8307/OXA細胞存活率的影響 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，添加黃連素對THC-8307和THC-8307/OXA細胞形態(tài)和生長狀態(tài)無影響，細胞均呈上皮樣單層排列、梭形、輪廓清晰，見圖1。噻唑藍檢測結果顯示，無論是THC-8307細胞還是THC-8307/OXA細胞，4組細胞存活率差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

圖1 不同濃度黃連素對THC-8307細胞和THC-8307/OXA細胞形態(tài)的影響(100×)

表1 不同濃度黃連素干預下THC-8307細胞和THC-8307/OXA細胞的存活率(x±s，%)

2.2 黃連素聯(lián)合OXA干預對THC-8307和THC-8307/OXA細胞存活率的影響 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與OXA對照組相比，添加黃連素(5、10、20 μg/mL)+OXA對THC-8307細胞形態(tài)和生長狀態(tài)無影響，但可有效抑制THC-8307/OXA細胞生長，可見細胞碎片增多、體積變小、胞質中黑色顆粒增多、貼壁細胞減少等現(xiàn)象(見圖2)。THC-8307細胞中，OXA對照組與不同濃度黃連素(5、10、20 μg/mL)+OXA組的細胞存活率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；THC-8307/OXA細胞中，OXA對照組、黃連素5 μg/mL+OXA組、黃連素10 μg/mL+OXA組、黃連素20 μg/mL+OXA組細胞存活率依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度黃連素+OXA干預下THC-8307和THC-8307/OXA細胞的存活率(x±s，%)

圖2 OXA+不同濃度黃連素對THC-8307細胞和THC-8307/OXA細胞形態(tài)的影響(100×)

2.3 黃連素干預對THC-8307/OXA細胞耐藥性的影響 不同濃度黃連素(5、10、20 μg/mL)+OXA組的IC50均低于OXA對照組，而逆轉倍數(shù)均高于OXA對照組(P<0.05)，見表3。

表3 4組IC50及逆轉倍數(shù)的比較(n=5，x±s)

3 討 論

腫瘤多藥耐藥增強是造成腫瘤治療失敗的主要原因，也是腫瘤藥物化療的主要障礙。化療增敏劑是解決多藥耐藥問題的有效手段之一，其可通過作用于生化代謝的特定環(huán)節(jié)或分子靶點而影響抗腫瘤藥物在細胞內(nèi)的作用，從而增強抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的殺傷作用或降低其對正常細胞的毒性。多藥耐藥的腫瘤細胞常常對非同一類型且結構、細胞靶點和作用機理迥然不同的多種抗癌藥物同時產(chǎn)生耐受，這使得抗癌治療陷入困境[7-8]。據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，全球每年約49萬腫瘤患者死亡，其中90%以上患者在不同程度上受到耐藥影響[9]。因此，克服腫瘤細胞的多藥耐藥，提高抗癌藥物療效，已成為腫瘤治療亟待解決的關鍵性問題，尋找相關藥物克服腫瘤多藥耐藥對提高癌癥治愈率具有重大意義。

研究表明，多種機制參與腫瘤多藥耐藥的形成，主要包括：(1)多種轉運蛋白，如P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白、肺耐藥蛋白等過度表達形成藥物泵，使抗癌藥物在腫瘤細胞內(nèi)蓄積下降[10-12]；(2)谷胱甘肽-S-轉移酶單獨或與谷胱甘肽共同參與的細胞毒素代謝及解毒系統(tǒng)誘導的腫瘤細胞保護機制[13]；(3)細胞凋亡相關因子及基因的異常表達[14-15]。近年來，中藥提取物的抗腫瘤作用逐漸受到重視。黃連素是從毛茛科黃連根狀莖中提取的一種季胺類化合物，其可作為消化道疾病用藥。研究表明，黃連素對肝臟腫瘤、結腸腫瘤、肺癌、白血病、食管癌、膀胱癌、腦部腫瘤等均有抑制作用[16-17]，但其機制尚不明確。本研究結果顯示，空白對照組不同濃度黃連素(5、10、20 μg/mL)組THC-8307和THC-8307/OXA細胞形態(tài)、生長狀態(tài)及存活率均無明顯差異，存活率均在90%以上，這表明濃度為5、10、20 μg/mL黃連素對THC-8307和THC-8307/OXA細胞無明顯毒性。在THC-8307細胞中，OXA對照組的細胞存活率低于20%，表明OXA對耐藥性低的THC-8307細胞具有明顯毒性，可有效抑制其生長。不同濃度黃連素(5、10、20 μg/mL)聯(lián)合OXA干預下，耐藥性低的THC-8307細胞形態(tài)、生長狀態(tài)和細胞存活率與OXA對照組相比無明顯差異；然而，在THC-8307/OXA細胞中，OXA對照組、黃連素5 μg/mL+OXA組、黃連素10 μg/mL+OXA組、黃連素20 μg/mL+OXA組的細胞存活率依次降低(P<0.05)。這提示黃連素聯(lián)合OXA可有效抑制耐藥細胞株THC-8307/OXA的生長，且抑制作用具有濃度依賴性；此外，與未加入黃連素的OXA組比較，不同濃度黃連素+OXA組的IC50均降低，而逆轉倍數(shù)升高，表明黃連素可逆轉THC-8307/OXA耐藥細胞對OXA的抗性，有效提高THC-8307/OXA耐藥細胞對OXA的敏感度，推測黃連素具有化療藥物OXA增敏劑的功效，可提高OXA抗腫瘤活性。

綜上所述，黃連素可顯著抑制耐OXA的結腸癌細胞株THC-8307/OXA的耐藥性，從而提高OXA對細胞生長的抑制作用，提示黃連素可作為化療藥物OXA增敏劑。這為臨床應用黃連素作為結腸癌的聯(lián)合化療用藥提供了理論依據(jù)，并為下一步研究黃連素抗人結腸癌細胞耐藥性的作用機制奠定基礎。