涂 婷 鄭曉梅 左清嬌 周子薇 先 耀

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川省瀘州市 646000，電子郵箱：1054328488@qq.com)

腦卒中已成為威脅全球居民生命健康的重大疾病[1]，其中出血性腦卒中具有發(fā)病率高、死亡率高以及致殘率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害患者的生命健康和生活質(zhì)量。研究表明，血腫周圍的腦組織在腦出血早期就已出現(xiàn)炎癥細(xì)胞和炎癥因子的浸潤，而這加重腦水腫[2]，因此，減輕炎癥反應(yīng)是緩解腦出血后繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵。腦出血后，血腫成分通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞觸發(fā)炎癥通路，而主要在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)作為一種模式識別受體，在免疫識別、炎癥調(diào)節(jié)等各個方面扮演著重要的角色[3]，其被激活后可以通過調(diào)控核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)信號通路促使大量的促炎細(xì)胞因子生成并釋放，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β等，從而引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[4]，因此抑制TLR4信號通路的激活有利于控制炎癥反應(yīng)。天然蝦青素是一種類胡蘿卜素類植物化學(xué)物，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、免疫增強(qiáng)等作用[5]。此外，蝦青素可有效通過血腦屏障，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[6]，故近年來蝦青素的神經(jīng)保護(hù)作用受到廣泛關(guān)注。本研究分析蝦青素對腦出血大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響，探究蝦青素的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無病原體級的SD雄性大鼠80只，體質(zhì)量(250±10)g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證編號:SCXK(川)2015-030。均飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動物房，用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飲用自來水，自然光照，平均室溫(25±2)℃。

1.2 主要試劑 蝦青素(索萊寶科技有限公司，批號:SA8730)、TLR4抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：ab22048)、NF-κB抗體(美國CST公司，批號：ab16502)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(英國Abcam公司，批號：ab37168)、酶聯(lián)免疫吸附測定法試劑盒(南京奧青生物技術(shù)有限公司，TNF-α批號：ANG-E11043R-1；IL-1β批號：ANG-E14252G)、辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔二抗(武漢ASPEN公司，批號：AS1107)、二喹啉甲酸蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(武漢ASPEN公司，批號：AS1086)、RIPA裂解液(武漢ASPEN公司，批號：AS1004)、顯影定影液(武漢ASPEN公司，批號：AS1027)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司，型號:CX-21)、冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號:TGL-16)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腦出血模型的建立與分組干預(yù)：(1)分組。按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為假手術(shù)組、腦出血組、蝦青素低劑量組、蝦青素高劑量組，每組20只。(2)建模。參照文獻(xiàn)[7]采用自體血注入法建立大鼠腦出血模型。大鼠稱重后，給予3%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于腦立體定位儀上，定位右側(cè)尾狀核(以前囟為中心，向后 0.2 mm，右側(cè)旁開3 mm，深6 mm)，鉆孔。除假手術(shù)組外，其余3組大鼠斷尾取血，采用經(jīng)典的“改良二次注血法”注血，第1次勻速注血20 μL(耗時2 min,留針7 min)，第2次以同樣速度注血30 μL(耗時4 min,留針10 min)，緩慢拔針、縫合、消毒，并對大鼠做好標(biāo)記。假手術(shù)組經(jīng)顱骨鉆孔后注入等體積生理鹽水。(3)干預(yù)。造模3 h后，參照文獻(xiàn)[8]分別給予蝦青素低劑量組和蝦青素高劑量組大鼠20 mg/kg、80 mg/kg的蝦青素灌胃(蝦青素采用花生油稀釋成1 mg/mL)，假手術(shù)組和腦出血組給予等量花生油灌胃，均1次/d，連續(xù)3 d。最后一次灌胃后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，每項(xiàng)指標(biāo)各組均隨機(jī)取5只大鼠進(jìn)行相關(guān)標(biāo)本采集。

1.3.2 神經(jīng)功能缺損評估及腦組織含水量的測定：隨機(jī)取5只大鼠按Garcia評分[9]標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，分?jǐn)?shù)越低，說明神經(jīng)功能障礙越重。過量麻醉(10%水合氯醛，劑量為0.35 mL/100 g)處死5只大鼠，斷頭取腦，稱量濕重，在90℃烤箱烘烤至恒重，稱量干重，計(jì)算腦組織含水量,腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測TNF-α和IL-1β的含量：過量麻醉(1%水合氯醛，劑量為0.35 mL/100 g)處死5只大鼠，斷頭取腦，取血腫周圍(0.2～0.3 cm)腦組織，加入RIPA裂解液(每100 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液)勻漿，1 000 r/min離心15 min，留取上清液，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測TNF-α和IL-1β的含量。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測TLR4 和 NF-κB蛋白的表達(dá)：過量麻醉(1%水合氯醛，劑量為0.35 mL/100 g)處死5只大鼠，斷頭取腦，取血腫周圍腦組織用4%多聚甲醛固定后，用石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度4 μm。置于載玻片上，4 ℃保存。將備用切片參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。于Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察，胞漿或胞核呈棕黃色者為陽性細(xì)胞。應(yīng)用 ImagePro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件測量TLR4陽性細(xì)胞表達(dá)的累積光密度值和NF-κB的陽性細(xì)胞率(%)。選擇經(jīng)免疫組化染色后的NF-κB切片，于低倍(40倍)顯微鏡下定位血腫周圍腦組織區(qū)域，切換至高倍(400倍)顯微鏡下選取5個不重復(fù)視野進(jìn)行拍照，采集圖像后用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件計(jì)算陽性細(xì)胞率；細(xì)胞核呈棕褐色為NF-κB表達(dá)陽性的細(xì)胞。

1.3.5 免疫印跡試驗(yàn)法檢測TLR4和NF-κB蛋白的含量：過量麻醉(1%水合氯醛，劑量為0.35 mL/100 g)處死5只大鼠，斷頭取腦，取血腫周圍腦組織，提取總蛋白，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，上樣行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉(5%脫脂牛奶室溫封閉1 h)，加入稀釋好的一抗(TLR4為1 ∶1 000；NF-κB為1 ∶2 000；GAPDH為1 ∶10 000)，4℃冰箱中孵育過夜，用TBST洗3次，5 min/次，加稀釋好的二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，最后用TBST在搖床上洗4次，5 min/次，根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件進(jìn)行顯影、定影。膠片采用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析，以GAPDH作為內(nèi)參，以目的條帶的灰度值/GAPDH條帶的灰度值為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較依據(jù)方差齊性檢驗(yàn)采用LSD-t法或Dunnett T3法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠Garcia 評分及腦組織含水量比較 假手術(shù)組、蝦青素高劑量組、蝦青素低劑量組、腦出血組的 Garcia 評分均依次降低，腦組織含水量依次增加(均P<0.05)，見表1。

表1 4組大鼠Garcia評分及腦組織含水量比較(x±s)

2.2 4組大鼠血腫周圍腦組織TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較 假手術(shù)組、蝦青素高劑量組、蝦青素低劑量組、腦出血組TNF-α、IL-1β表達(dá)水平均依次增加(均P<0.05)，見表2。

表2 4組大鼠血腫周圍腦組織TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較(x±s，pg/mg)

2.3 4組大鼠血腫周圍腦組織TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)水平比較 免疫組織化學(xué)法及免疫印跡試驗(yàn)法檢測結(jié)果均顯示，假手術(shù)組、蝦青素高劑量組、蝦青素低劑量組、腦出血組TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)水平均依次增加(均P<0.05)，見圖1及表3。

圖1 免疫印跡試驗(yàn)法檢測各組血腫周圍腦組織中TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)

表3 4組大鼠血腫周圍腦組織TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)水平比較(x±s)

3 討 論

腦出血后，血腫周圍腦組織的炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)繼發(fā)性損傷的主要病理機(jī)制，因此目前對腦出血后過度炎癥反應(yīng)的干預(yù)仍然是研究熱點(diǎn)。炎癥的發(fā)生機(jī)制涉及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、炎性細(xì)胞的滲入、細(xì)胞因子和炎癥趨化因子的釋放，以上事件最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而加劇腦損傷。TLR4主要在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，為一種模式識別受體[3]，在觸發(fā)炎癥通路中起重要作用：細(xì)胞外信號與小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4受體結(jié)合后誘導(dǎo)NF-κB活化，NF-κB激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，通過調(diào)控TNF-α、IL-1β等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，使炎癥介質(zhì)過表達(dá)并最終形成炎癥瀑布效應(yīng)；而TNF-α、IL-1β等炎癥因子同時又是NF-κB的激活劑，由此形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致持久的炎性反應(yīng)，進(jìn)而加重腦水腫及神經(jīng)細(xì)胞損傷[10-11]。因此，負(fù)性調(diào)控TLR4介導(dǎo)的炎癥信號通路，是減輕腦出血后繼發(fā)性炎癥損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

蝦青素是一種重要的脂溶性類胡蘿卜素，可通過血腦屏障，進(jìn)而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等作用。早在1999年，蝦青素的食用安全性就已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可，其被美國食品藥物管理局批準(zhǔn)作為膳食添加劑[12]。大量研究表明，蝦青素能明顯減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。例如，Zhang等[13]的研究結(jié)果表明，早期使用蝦青素可以抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，減少促炎因子IL-1β、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)，從而對早期腦損傷起改善作用。吳杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素可抑制炎癥因子的表達(dá)，減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。還有研究表明，蝦青素對脂多糖刺激下IPEC-J2細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)有抑制作用，其對細(xì)胞的保護(hù)作用與TLR4/髓樣分化因子88/NF-κB 信號通路相關(guān)[15]。此外，蝦青素還被證實(shí)在腦梗死、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦外傷、脊髓損傷、帕金森綜合征等疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用[8,13,16-18]，但國內(nèi)外有關(guān)蝦青素對腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究報(bào)告較少。本研究觀察蝦青素對腦出血大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響，探討其可能的腦保護(hù)機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組、蝦青素高劑量組、蝦青素低劑量組、腦出血組Garcia評分依次降低，而腦組織含水量及血腫周圍腦組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平依次增加(均P<0.05)，與相關(guān)研究結(jié)果[13]相似，提示蝦青素可能通過抑制腦出血大鼠TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)，從而下調(diào)炎癥因子TNF-ɑ、IL-1β的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)功能的作用，且其保護(hù)作用有劑量依賴性。

綜上所述，蝦青素對腦出血大鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能為抑制血腫周圍組織TLR4/NF-κB信號通路的激活，從而下調(diào)炎癥因子TNF-ɑ、IL-1β的表達(dá)，從而減輕繼發(fā)性炎癥損傷及腦水腫。但蝦青素腦保護(hù)作用的具體機(jī)制仍不清楚，且最佳使用劑量仍不確切，有待今后更深入的研究以明確。