李倩茹 張?？?孟 蓮 劉春霞

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，新疆地方病與民族疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子市 832002，電子郵箱：1509094295@qq.com；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，新疆石河子市832002)

脂肪肉瘤包括去分化脂肪肉瘤、黏液樣脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma，MLPS)及多形性脂肪肉瘤等多種組織學(xué)亞型，而MLPS約占脂肪肉瘤的30%[1-2]。雖然治療后MLPS患者的生存率得到很大提高，但目前的化療方案對(duì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性患者的治療效果仍不佳[3-4]。目前MLPS發(fā)生的確切機(jī)制尚不清楚[4]。因此，探索MLPS遺傳和表觀遺傳變化相關(guān)的特定生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，可為患者的預(yù)后判斷提供依據(jù)。大量研究表明，甲基化是表觀遺傳的關(guān)鍵修飾因子之一，其不僅是腫瘤發(fā)生的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制，還可為尋找人類疾病相關(guān)生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供方向[5-7]。在CpG島中，異常甲基化可影響癌基因和抑癌基因的功能，然而目前關(guān)于DNA甲基化對(duì)單個(gè)基因影響的研究仍然不充分。因此，本研究基于數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定MLPS中甲基化調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因(methylation-regulated differentially expressed genes，MeDEGs)，利用一系列分析工具篩選出異常甲基化基因，為MLPS的發(fā)生、診斷及預(yù)后判斷提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源 本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中篩選出基因系列集GSE59568[8]和DNA甲基化系列集GSE52391[3]。GSE59568包含6個(gè)MLPS組織樣本(MLPS組)和3個(gè)正常脂肪組織樣本(對(duì)照組)；GSE52391包含10個(gè)MLPS組織樣本(MLPS組)和2個(gè)正常脂肪組織樣本(對(duì)照組)。對(duì)上述2個(gè)數(shù)據(jù)集中的樣本進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 鑒定MeDEGs 采用GEO 自帶的GEO2R分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)，對(duì)GSE59568和GSE52391系列集進(jìn)行分析，以P<0.05、|log(FC)| >1和P<0.05、|t| >2為標(biāo)準(zhǔn)，分別篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)和差異甲基化基因(differentially methylated genes，DMGs)。隨后使用Venny 2.1.0在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)分別重疊上調(diào)(下調(diào))的DEGs和甲基化過(guò)低(高)的DMGs，得到上調(diào)(下調(diào))的低(高)甲基化的MeDEGs。

1.3 MeDEGs的富集分析 采用DAVID軟件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對(duì)MeDEGs分別進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05為有效。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和功能模塊分析 通過(guò)STRING在線分析工具(https://string-db.org/)得到MeDEGs的蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，中信度分?jǐn)?shù)> 0.4時(shí)被認(rèn)為重要。以TSV格式輸出，并導(dǎo)入Cytoscape軟件(http://www.cytoscape.org/download.php；版本3.5.1)。在Cytoscape軟件引入插件cytoHubba篩選PPI網(wǎng)絡(luò)的Hub基因，同時(shí)使用插件MCODE構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)的功能模塊。

1.5 Hub基因的甲基化表達(dá)水平和基因表達(dá)水平與生存分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行的分析網(wǎng)站，使用此工具分析肉瘤與正常組織樣本之間的DNA甲基化和基因表達(dá)水平差異，最終生成用于關(guān)系可視化的箱線圖。使用Kaplan-Meier法評(píng)估MeDEGs中Hub基因與肉瘤患者總生存率的關(guān)系，進(jìn)而了解異常甲基化基因與MLPS患者的預(yù)后關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 MLPS的MeDEGs 從GSE59568數(shù)據(jù)集的MLPS組織和正常脂肪組織中鑒定出1 007個(gè)上調(diào)和1 298個(gè)下調(diào)的DEGs(見圖1A)。從GSE52391數(shù)據(jù)集的MLPS組織和正常脂肪組織中篩選出597個(gè)甲基化過(guò)高的DMGs和3 577個(gè)甲基化過(guò)低的DMGs。(見圖1B)。為了獲得DEGs與DMSs呈負(fù)相關(guān)異常甲基化調(diào)控的差異基因；重疊了597個(gè)高甲基化DMGs和1 298個(gè)下調(diào)的DEGs，獲得78個(gè)下調(diào)的MeDEGs(圖2A)；重疊了3 577個(gè)低甲基化DMGs與1 007個(gè)上調(diào)的DEGs，獲得143個(gè)上調(diào)的MeDEGs(圖2B)。

圖1 DEGs的火山圖和DMGs的熱圖

圖2 獲得的MeDEGs

2.2 MeDEGs的GO功能和KEGG通路富集分析 使用DAVID對(duì)全部MeDEGs進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析。結(jié)果顯示，MLPS的MeDEGs主要參與細(xì)胞增殖的正負(fù)調(diào)控、凋亡、核糖體結(jié)構(gòu)成分和蛋白結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程，見表1；MLPS的MeDEGs富集在核糖體、癌癥、RAS相關(guān)蛋白1(RAS-associated protein，Rap1)、AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和Ras 等信號(hào)通路，見表2。

表1 MLPS中MeDEGs的GO富集分析結(jié)果

表2 MLPS中MeDEGs的KEGG通路富集分析結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和Hub基因 通過(guò)STRING和Cytoscape繪制MeDEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行圖像可視化，使用MCODE插件篩選PPI功能模塊，其中頂級(jí)模塊主要富集在核糖體，見圖3。使用插件cytoHubba篩選出前20個(gè)Hub基因，包含核糖體蛋白質(zhì)家族成員核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)L9、RPL31、RPL36、RPS2、RPS21、RPL39L、RPL15、RPS23、NHP2、細(xì)胞質(zhì)多聚(A)結(jié)合蛋白1[poly(A)binding protein，cytoplasmic 1,PABPC1]、細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白(cell division cycle-associated protein,CDCA)5、非SMC凝縮素Ⅰ復(fù)合亞基G(non-SMC condensin Ⅰ complex,subunit G,NCAPG)、甲狀腺激素受體相互作用物13(thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13)、無(wú)齒的E3泛素蛋白連接酶同源(denticleless E3 ubiquitin protein ligase homolog,DTL)、無(wú)缺口同源物1(notchless homolog 1,NLE1)、Geminin DNA復(fù)制抑制劑(Geminin,DNA replication inhibitor,GMNN)、胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase,TYMS)、CDC7、小核糖核蛋白D2多肽(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide D2,SNRPD2)和BYSL基因，這20個(gè)Hub基因皆為上調(diào)的MeDEGs，見表3。

圖3 MeDEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)和頂級(jí)模塊

表3 MeDEGs中前20個(gè)Hub基因

2.4 Hub基因在肉瘤中的甲基化和基因表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)UALCAN工具的分析結(jié)果，在肉瘤組織中發(fā)現(xiàn)RPL36、RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS、SNRPD2和BYSL的甲基化和基因表達(dá)與MLPS中的表達(dá)相同，見圖4A。泛癌分析結(jié)果還顯示這些基因在大部分腫瘤中顯著上調(diào)，見圖4B。采用Kaplan-Meier法評(píng)估這些上調(diào)基因與肉瘤患者的預(yù)后關(guān)系，結(jié)果顯示RPS2(P=0.008)、CDCA5(P=0.017)、NCAPG(P=0.013)、NLE1(P=0.001)、TYMS(P=0.002)和BYSL(P<0.001)的mRNA表達(dá)升高與肉瘤患者不良預(yù)后相關(guān)(見圖5)。由此推斷，RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL基因可能是MLPS患者預(yù)后的潛在獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

圖4 各基因在不同腫瘤中的甲基化及基因表達(dá)水平

圖5 RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL基因表達(dá)水平與肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

分子病理流行病學(xué)是使用腫瘤標(biāo)志物替代疾病病理學(xué)的一種新興學(xué)科，它將分子病理學(xué)和數(shù)據(jù)科學(xué)相結(jié)合以幫助精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的開展。目前，利用分子病理流行病學(xué)可深入探索腫瘤的病因、發(fā)展、預(yù)后和結(jié)局[9-11]。在分子病理流行病學(xué)中，異常甲基化基因作為腫瘤有關(guān)的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)，已受到廣泛關(guān)注[12-13]。以往的研究主要集中在MLPS單個(gè)基因與甲基化之間的相關(guān)性，缺乏對(duì)DNA甲基化的系統(tǒng)分析。因此，迫切需要在MLPS患者中鑒定和分析MeDEGs，為后續(xù)探索腫瘤的預(yù)后標(biāo)記物以及治療靶點(diǎn)提供可行的參考。

本研究結(jié)果顯示，RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL基因是MLPS中上調(diào)的MeDEGs，且這些基因的過(guò)表達(dá)與肉瘤患者預(yù)后差有關(guān)(均P<0.05)。RPS2是一種核糖體蛋白，其高表達(dá)與細(xì)胞增殖有關(guān)，并且可促進(jìn)前列腺癌、結(jié)直腸癌以及星形細(xì)胞瘤的形成[14-16]，可作為結(jié)直腸癌[15]和前列腺癌[14]的潛在治療靶點(diǎn)。CDCA5在控制細(xì)胞周期進(jìn)程中起重要作用[17-18]，其表達(dá)過(guò)高與肺癌[19]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[18]、肝癌[20]等多種癌癥患者預(yù)后差有關(guān)。NCAPG參與細(xì)胞分裂期間染色體的濃縮和穩(wěn)定化，其與肝癌的多發(fā)有關(guān)，而低表達(dá)可抑制體內(nèi)肝癌的腫瘤生長(zhǎng)，該基因可能為未來(lái)治療肝癌提供了新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[21-22]。NLE1編碼一種新的含WD40重復(fù)序列的蛋白質(zhì)，可調(diào)節(jié)Notch信號(hào)傳導(dǎo)活性，但其作用機(jī)制仍未明確[23]。TYMS是一種基礎(chǔ)的代謝酶，抑制TYMS已被證明是一種有效的人類癌癥治療方法。已有研究報(bào)告，TYMS在結(jié)腸癌對(duì)5-氟尿嘧啶耐藥性以及晚期乳腺癌患者對(duì)培美曲塞的耐藥性中起關(guān)鍵作用[24-25]。除了與耐藥性有關(guān)外，TYMS高表達(dá)還與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[26-27]。BYSL存在于人類滋養(yǎng)細(xì)胞中，雖然BYSL在腫瘤發(fā)生中的具體生物學(xué)作用仍有待確定，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在肝細(xì)胞癌中上調(diào)，并且是癌細(xì)胞增殖中細(xì)胞核生成所必需的[28]。還有學(xué)者基于BYSL的黏附和侵入功能發(fā)現(xiàn)，其在神經(jīng)性癌中發(fā)揮作用，且是神經(jīng)性癌的一種重要治療靶標(biāo)[29]。雖然RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL基因?qū)LPS的作用尚不明確，但綜合以上研究和本研究結(jié)果推測(cè)，基因的異常甲基化有可能是MLPS發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。

本研究進(jìn)一步進(jìn)行了功能富集分析，以闡明甲基化在MLPS中的作用。GO分析顯示，MeDEGs主要富集在細(xì)胞增殖的正負(fù)調(diào)節(jié)和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。與正常細(xì)胞相比，異常細(xì)胞增殖或凋亡被認(rèn)為是癌細(xì)胞的顯著特征，這意味著多個(gè)癌基因或抑癌基因呈高或低甲基化。此外，Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)被富集。研究顯示，Wnt信號(hào)通路的突變經(jīng)常發(fā)生在人類癌癥中，且其扮演不同的角色[30-31]。GO功能和KEGG通路分析結(jié)果均涉及核糖體，表明富集在核糖體的多個(gè)基因受異常甲基化的高度調(diào)控。近來(lái)已有研究證實(shí)核糖體是結(jié)腸癌發(fā)展的重要機(jī)制[32]。除了核糖體外，KEGG也富集在癌癥、Rap1信號(hào)、AMPK信號(hào)和Ras信號(hào)等通路。Rap1被認(rèn)為是一種可以逆轉(zhuǎn)Ras轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)，是控制整合素激活的關(guān)鍵介質(zhì)[33]。最近有研究表明，Rap1通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的Ras同源家族A活性來(lái)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞遷移[34]。Ras蛋白是多種癌癥的重要調(diào)節(jié)因子，主要調(diào)控活性鳥苷三磷酸和無(wú)活性鳥苷二磷酸兩者之間的轉(zhuǎn)換[35]。AMPK主要在能量平衡和能量代謝中起作用，是代謝疾病的潛在治療靶標(biāo)[36]。上述研究結(jié)果表明核糖體、Rap1信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路和Ras信號(hào)通路都可能是闡明MLPS機(jī)制的重要研究靶點(diǎn)。

綜上所述，RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL等基因的異常甲基化可能與MLPS的發(fā)病及預(yù)后密切相關(guān)，這或可為進(jìn)一步研究MLPS的發(fā)生和發(fā)展、篩選預(yù)后標(biāo)記物以及治療靶點(diǎn)等提供新的方向。