杜 贏 牛煥紅 馬 科

(1 西安工會(huì)醫(yī)院兒科，陜西省西安市 710100，電子郵箱：duying5405@sina.com；2 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科，陜西省西安市 710032；3 延安大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，陜西省延安市 716000)

反復(fù)呼吸道感染(recurrent respiratory tract infection，RRTI)是兒科常見(jiàn)的多發(fā)病，兒童RRTI的發(fā)病率在20%左右[1]，其可嚴(yán)重影響患兒身體發(fā)育和健康狀況。RRTI病程長(zhǎng)、易反復(fù)、易發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，且不易治愈，嚴(yán)重時(shí)可危及患兒心、肺、腦等重要器官。RRTI發(fā)病原因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，營(yíng)養(yǎng)不良、環(huán)境中病原微生物等因素均可能導(dǎo)致兒童發(fā)生RRTI[2]，而兒童機(jī)體免疫力下降、先天或后天免疫機(jī)制缺陷是RRTI發(fā)生的主要原因。微小RNA(micro RNA,miR)與機(jī)體免疫功能異常存在密切關(guān)系[3]。miR-146a、miR-155是目前頗受關(guān)注的兩種miR亞型。其中miR-146a位于第5q34染色體上，已被證實(shí)參與多種免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展，如強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[4]。miR-155在多種免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞中被檢測(cè)到有表達(dá)，被認(rèn)為與多種炎癥相關(guān)的因子和信號(hào)蛋白調(diào)控有關(guān)[5]。有研究結(jié)果顯示，miR-146a、miR-155均與免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程密切相關(guān)，可參與部分免疫細(xì)胞的形成過(guò)程，在某些免疫性疾病中表達(dá)水平異常升高[6]。目前，關(guān)于miR-146a、miR-155的研究多圍繞類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等典型免疫性疾病開(kāi)展，鮮有針對(duì)RRTI的研究。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)RRTI患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miR-146a、miR-155的表達(dá)水平，探討RRTI與RRTI患兒機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫狀態(tài)的關(guān)系，并評(píng)估m(xù)iR-146a、miR-155對(duì)小兒RRTI的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年5月至2019年5月在西安工會(huì)醫(yī)院兒科確診為RRTI的100例患兒作為研究組，其中男性53例、女性47例，年齡2個(gè)月至13歲[(8.69±2.46)歲]，2個(gè)月≤年齡≤2歲20例，2歲<年齡≤5歲42例，5歲<年齡≤13歲38例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《反復(fù)呼吸道感染的臨床概念和處理原則》[7]中關(guān)于RRTI的判定標(biāo)準(zhǔn)。(2)年齡0～14周歲；(3)患兒兩次感染間隔不少于8 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并先天性心臟病、先天性氣道發(fā)育異常等患兒；(2)1個(gè)月之內(nèi)服用過(guò)免疫調(diào)節(jié)劑、腎上腺激素者；(3)嚴(yán)重肝、腎、心、肺功能不全者；(4)不配合本研究者。選取同期在本院進(jìn)行體檢的100例健康兒童為對(duì)照組，其中男性51例、女性49例，年齡2個(gè)月至13歲[(8.58±2.72)歲]，2個(gè)月≤年齡≤2歲18例，2<年齡≤5歲45例，5歲<年齡≤13歲37例。研究組與對(duì)照組兒童的年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑與儀器 TRI Reagent?BD RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Molecular Research Center公司(貨號(hào)：TB126)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)K1622)；AceQ qPCR SYBR?Green Master Mix定量PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(貨號(hào)：Q221-01)；引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成；C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、IgG、IgA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(貨號(hào)：ml057570、ml025149、ml025158)；IgM ELISA試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司(貨號(hào)：BMS2098)；CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；BC-5800型五分類血球分析儀購(gòu)自中國(guó)邁瑞公司；日立7600全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自株式會(huì)社日立制作所。

1.3 樣本采集 研究組患兒確診次日采集空腹外周靜脈血6 mL，對(duì)照組兒童于體檢時(shí)采集空腹外周靜脈血6 mL。立即取其中3 mL加入無(wú)菌肝素抗凝管(20 IU/mL)，下層血細(xì)胞用于提取PBMC，使用密度梯度離心法分離PBMC；余下3 mL在4℃條件下靜置促凝，30 min后，3 000 r/min離心10 min，取血清，置于-80℃低溫冷凍備用。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)miR-146a、miR-155表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取PBMC中的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)miR-146a、miR-155進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共10 μL：miScript SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)條件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；45個(gè)循環(huán)。miR-146a、miR-155及內(nèi)參U6的引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法對(duì)血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 引物序列

1.5 感染指標(biāo)、免疫指標(biāo)檢測(cè) 采用BC-5800型五分類血球分析儀檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)；全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定患兒血清CRP、IgG、IgA、IgM水平，檢測(cè)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為控制檢測(cè)質(zhì)量，本次研究所有樣品的檢測(cè)均由檢驗(yàn)科同一批人員在同一臺(tái)儀器上操作，每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)；采用Logistic回歸模型分析RRTI發(fā)病的影響因素；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析相關(guān)指標(biāo)的診斷效能，應(yīng)用正態(tài)z檢驗(yàn)(MedCalc軟件)對(duì)曲線下面積(area under the curve，AUC)進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組PBMC中miR-146a和miR-155表達(dá)水平的比較 研究組PBMC中miR-146a、miR-155的相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組PBMC中miR-146a和miR-155相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 兩組血清感染指標(biāo)和體液免疫指標(biāo)水平的比較 與對(duì)照組比較，研究組CRP水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)較高，而IgA、IgM、IgG水平較低(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組血清感染指標(biāo)和體液免疫指標(biāo)水平的比較(x±s)

2.3 RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平與感染和免疫指標(biāo)的相關(guān)性 RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平與白細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，而與IgA、IgM、IgG水平均呈正相關(guān)，且miR-146a與miR-155相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)(均P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平與感染和免疫指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 影響RRTI發(fā)生的危險(xiǎn)因素 以血清IgA、IgM、IgG水平和PBMC中miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平為自變量，以是否發(fā)生RRTI為因變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，變量賦值見(jiàn)表5，賦值時(shí)所取的分界值均為研究組各變量的平均值。結(jié)果顯示，miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平降低，以及IgA、IgM、IgG水平降低均是影響RRTI發(fā)生的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見(jiàn)表6。

表5 變量賦值情況

表6 影響RRTI發(fā)生的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 PBMC中miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平對(duì)RRTI的診斷效能 PBMC中miR-146a相對(duì)表達(dá)水平診斷RRTI的AUC為0.826(95%CI：0.795～0.858；P<0.001)，截?cái)嘀禐?.675，靈敏度為80.60%，特異度為80.80%；PBMC中miR-155相對(duì)表達(dá)水平診斷RRTI的AUC為0.859(95%CI：0.829～0.889；P<0.001)，截?cái)嘀禐?.904，靈敏度為87.10%，特異度為85.00%；兩者聯(lián)合診斷RRTI的AUC為0.905(95%CI：0.880～0.930；P<0.001)，靈敏度為84.90%，特異度為91.20%。兩者聯(lián)合診斷RRTI的AUC均大于miR-146a、miR-155單獨(dú)診斷(z=3.724，P<0.001；z=2.502，P=0.012)。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平以及二者聯(lián)合診斷RRTI的ROC曲線

3 討 論

RRTI是兒科臨床常見(jiàn)病，與小兒機(jī)體免疫功能低下及免疫功能紊亂有密切關(guān)系。RRTI患兒在一定程度上會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞免疫和體液免疫功能降低[8-9]。miR是一類含多個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，其通過(guò)抑制靶基因的表達(dá)參與疾病的病理過(guò)程，在機(jī)體免疫中有著舉足輕重的作用[10]。例如，周玉蘭等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓模型損傷大鼠血清中，miR-146可抑制白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8等炎癥因子水平，從而顯著減輕炎癥反應(yīng)[11]；哮喘患兒血清miR-155水平較對(duì)照組顯著降低，且miR-155水平與血清炎癥因子水平有關(guān)[12]。本研究中，RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平低于健康兒童，且兩者的相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)；Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平降低均是RRTI發(fā)生的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。這提示miR-146、miR-155異常表達(dá)與RRTI發(fā)生有關(guān)，兩者可能共同參與調(diào)控RRTI的發(fā)病。

免疫球蛋白在體液免疫中有著舉足輕重的地位，其特異性地與抗原結(jié)合并激活補(bǔ)體，進(jìn)而對(duì)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用加以調(diào)理，進(jìn)一步發(fā)揮抗菌、抗病毒作用。王琦等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，RRTI患兒血清IgG、IgA水平顯著降低，炎癥細(xì)胞因子IL-6水平顯著升高。進(jìn)一步證實(shí)體液免疫與細(xì)胞免疫紊亂參與RRTI病情的發(fā)生和發(fā)展。此外，研究表明CRP、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等感染指標(biāo)可以反映呼吸道感染疾病的病情嚴(yán)重程度和轉(zhuǎn)歸情況[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，研究組CRP水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)較高，免疫球蛋白IgA、IgM、IgG水平較低(P<0.05)，與上述文獻(xiàn)報(bào)告的結(jié)果相似；同時(shí)，RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)水平與白細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，與血清IgA、IgM、IgG呈正相關(guān)(均P<0.05)。由此推測(cè)miR-146a、miR-155表達(dá)水平的降低，可能促使細(xì)胞炎癥因子如IL-6的表達(dá)增加而使機(jī)體炎癥損傷嚴(yán)重，進(jìn)一步促使細(xì)胞免疫功能降低和體液免疫功能紊亂，導(dǎo)致RRTI的發(fā)生。

我們進(jìn)一步行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，RRTI患者PBMC中的miR-146a、miR-155的相對(duì)表達(dá)水平對(duì)RRTI具有一定的診斷效能，兩者聯(lián)合診斷RRTI的曲線下面積達(dá)0.905，高于單一指標(biāo)單獨(dú)診斷，且靈敏度為84.90%，特異度為91.20%。這提示外周血PBMC中的miR-146a、miR-155水平均可用于RRTI的診斷，以篩查疑似RRTI患兒，而兩者聯(lián)合檢測(cè)時(shí)可進(jìn)一步提高診斷效能。

綜上所述，RRTI患兒外周血PBMC中miR-146a、miR-155的表達(dá)水平顯著降低，兩者可能共同參與免疫炎癥調(diào)控過(guò)程，進(jìn)而導(dǎo)致RRTI的發(fā)生，兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)小兒RRTI診斷有一定臨床價(jià)值。本研究不足之處在于取樣均來(lái)自同一醫(yī)院，樣品來(lái)源具有單一性，且樣本量較少，因此計(jì)劃下一步擴(kuò)大樣本來(lái)源和范圍進(jìn)行深入研究。