王 萍 王 穎 萬 紅 段 飛 燕樹勛

(1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科二病區(qū)，鄭州市 450000；2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心血管科，河南省鄭州市 450000，電子郵箱：wangping2016a@163.com)

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是全球公認(rèn)的健康“隱形殺手”[1]。MS包括糖脂代謝紊亂、高血壓、高尿酸血癥等，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。既往認(rèn)為，胰島素抵抗是MS發(fā)病的核心機(jī)制，而肥胖、炎癥反應(yīng)、環(huán)境因子、遺傳因子是胰島素抵抗的影響因素[2]。但也有學(xué)者認(rèn)為，盡管血糖升高與胰島素抵抗密切相關(guān)，但肥胖或能量失衡與MS危險因素的關(guān)聯(lián)性更緊密[3]。臨床發(fā)現(xiàn)，在相同的遺傳背景和能量攝入條件下，人體高血糖和體重增加等的表現(xiàn)差異較大[4-5]。多項研究表明，腸道菌群與代謝性疾病關(guān)系密切，MS進(jìn)程中的糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激炎性反應(yīng)等均可引起腸道菌群改變，腸道菌群的紊亂又可加速M(fèi)S的進(jìn)展[6-7]。腸道菌群能夠影響宿主的糖、脂肪、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，并維持腸黏膜功能正常[8]，是宿主的一個“能量代謝器官”[9-10]。目前對MS的治療側(cè)重于單一的減重、降糖、調(diào)脂、降壓等，缺乏特異性多靶點(diǎn)治療藥物，而通過不同方式調(diào)節(jié)腸道菌群，改善代謝紊亂，是一種潛在的治療方法。然而，目前關(guān)于腸道菌群與MS關(guān)系的研究仍以動物實驗為主，本研究觀察MS患者的腸道菌群特點(diǎn)，分析腸道微生物與MS的內(nèi)在聯(lián)系，以期為臨床治療MS提供新的治療靶點(diǎn)和個性化的防治策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年3～5月于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院治療的26例MS患者為觀察組，其中男性14例，女性12例，年齡36～63(41.60±6.85)歲。另選取32例在社會招募及在河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院參與健康體檢的健康志愿者為對照組，其中男性18例，女性14例，年齡35～60(42.67±6.36)歲。MS組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會制定的MS診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]；(2)漢族，年齡35～65歲。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)身體狀況良好的非MS人群；(2)漢族，年齡35～65歲，無不良生活習(xí)慣(如抽煙、喝酒、長期飲用碳酸飲料)；(3)常規(guī)體檢項目均在正常值范圍。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1周內(nèi)有感染、發(fā)熱、創(chuàng)傷、燒傷的患者或活動性肺結(jié)核病或風(fēng)濕免疫疾病者；(2)有較嚴(yán)重的腸道疾病或代謝性疾病史，近4周內(nèi)有腹瀉、便秘等胃腸道反應(yīng)；(3)合并甲狀腺功能異常等其他內(nèi)分泌疾病、冠心病、心臟瓣膜病(1個及以上瓣膜發(fā)生中度病變)或原發(fā)性心肌病、嚴(yán)重肺部疾病及腦血管疾病、腎功能不全(血清肌酐男性>221 μmol/L，女性>177 μmol/L)、肝功能不全[谷丙轉(zhuǎn)氨酶>正常值(40 U/L)的3倍]或合并肝硬化、造血系統(tǒng)或惡性腫瘤等嚴(yán)重原發(fā)性疾病、臟器移植、既往有手術(shù)史者；(4)近3個月內(nèi)使用過可能影響腸道菌群變化的藥物，如抗生素、非甾體類藥物、微生態(tài)制劑、胃腸動力藥物等；(5)嚴(yán)重精神障礙患者(如感知障礙、思維障礙等)；(6)孕婦、哺乳期婦女；(7)正參加其他臨床試驗的志愿者；(8)標(biāo)本留取過程中有污染者、未及時凍存者、標(biāo)本留取量不足者。兩組研究對象之間無血緣關(guān)系，年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。所有研究對象均自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集和檢測方法 樣本采集前，采用調(diào)查問卷詳細(xì)記錄受試者的年齡、性別、飲食習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)(三餐飲食習(xí)慣、飲食量及食物結(jié)構(gòu)配比)等特征。糞便樣本采集前排凈小便。用無菌一次性采樣杯采集新鮮糞便樣本后保存于常溫保存液中(含樣品保護(hù)液)，7 d內(nèi)完成DNA提取。

由博奧頤和健康科學(xué)技術(shù)(北京)有限公司采用PCR技術(shù)擴(kuò)增和Illumina MiSeq高通量測序平臺分析兩組研究對象腸道菌群的結(jié)構(gòu)和屬水平上的相對豐度。糞便樣本采用16S rRNA細(xì)菌檢測技術(shù)鑒定腸道菌群。16S rRNA細(xì)菌檢測方法為：采用糞便提取試劑盒(天根生化科技有限公司，批號：DP711-T1)對糞便樣本進(jìn)行基因組DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA純度和濃度。隨后采用KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit(美國KAPA Biosystems，批號：KK2602)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)，上下游引物序列分別為5′-X-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；PCR反應(yīng)體系包含0.25 μL高保真聚合酶，5 μL 5×反應(yīng)緩沖液，5 μL 5×高GC緩沖液，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，10 μL模板DNA，1 μL正向引物(10 μmol/L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)，11.25 μL超純水；PCR擴(kuò)增程序為98℃預(yù)變性5 min，98℃變性0.5 min、50℃退火0.5 min、0.5 min延伸72 ℃共25個循環(huán)，72℃擴(kuò)展延伸5 min。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司，批號：AP-GX-50)切膠回收PCR產(chǎn)物，采用Tris-Hcl洗脫回收產(chǎn)物；將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，按照對DNA量的測序要求將各樣本按比例混合后構(gòu)建Illumina平臺文庫并測序。

1.3 質(zhì)量控制 前期培訓(xùn)所有調(diào)查人員，使其掌握相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)重復(fù)檢測10%的糞便樣本。糞便腸道菌群由博奧頤和健康科學(xué)技術(shù)(北京)有限公司統(tǒng)一檢測。由不同人員采用Excel軟件采取雙人雙錄入模式錄入數(shù)據(jù)。

1.4 生物信息學(xué)分析 采用Trimmomatic軟件(v0.27)[博奧顧和健康科學(xué)技術(shù)(北京)有限公司]以滑動窗口法對雙端的核酸序列進(jìn)行質(zhì)量過濾。利用Vsearch軟件(v2.8.1)依照97%相似性劃分分類操作單元，聚類時剔除嵌合體；基于分類操作單元的聚類分析結(jié)果和分類學(xué)信息對各個分類水平進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。通過Mothur 1.31.2軟件獲得Alpha多樣性指數(shù)中的Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)；Ace指數(shù)反映標(biāo)本中菌群豐度，即分類操作單元數(shù)量；Shannon指數(shù)反映菌群的多樣性，包括菌群豐度和菌群均勻度。采用Qiime軟件(v2.1)計算標(biāo)本間un-weighted unifrac距離矩陣以分析菌群的β多樣性，并繪制主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)圖形。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Excel 2013及SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗或t′檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M(P25，P75)表示，比較采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組樣品主坐標(biāo)分析結(jié)果 PCoA結(jié)果可顯示菌群在不同環(huán)境下的相似性和差異性。圖1中每個點(diǎn)都代表1個檢測樣本的菌群，點(diǎn)與點(diǎn)間距離大小代表菌群之間的相似性，距離越小越相似；觀察組和對照組在PCoA圖上均能各自聚類，說明兩類人群的腸道菌群β多樣性具有差異。見圖1。

圖1 兩組樣品PCoA圖

2.2 兩組樣品多樣性分析 觀察組Ace指數(shù)為82.76±7.47，Shannon指數(shù)為4.22±0.82；對照組Ace指數(shù)為157.54±10.76，Shannon指數(shù)為7.73±1.92；觀察組Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)均低于對照組(t=30.022，P<0.001；t′=9.346，P<0.001)。

2.3 兩組樣品微生物屬水平上的相對豐度 觀察組的芽孢桿菌屬、梭菌屬、普雷沃氏菌屬、巨單胞菌屬、腸球菌屬的豐度高于對照組，瘤胃球菌屬、毛螺菌屬的豐度低于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組樣品微生物屬水平上的相對豐度[M(P25，P75)]

3 討 論

厚壁菌門中的大多數(shù)細(xì)菌可產(chǎn)生丁酸鹽，研究表明，肥胖小鼠腸道丁酸鹽含量明顯高于非肥胖小鼠，且產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌含量增加可加強(qiáng)宿主的攝食能力，導(dǎo)致肥胖的發(fā)生[12-13]，而腹型肥胖為MS發(fā)生的核心機(jī)制之一[3]。芽孢桿菌在健康成人胃腸道中存在的比例較少，而相對于普通人群，肥胖人群腸道中芽孢桿菌含量明顯升高[14]。波士頓醫(yī)學(xué)中心的研究人員證實梭菌感染是肥胖發(fā)生的可能風(fēng)險因子[15]。Zhang等[16]的研究證實肥胖者腸道中的普雷沃氏菌含量豐富。普雷沃氏菌可參與碳水化合物和蛋白質(zhì)的發(fā)酵，促進(jìn)機(jī)體更有效地從食物中攝取營養(yǎng)成分[17]。巨單胞菌可發(fā)酵各種碳水化合物產(chǎn)生乙酸、丙酸和乳酸，乙酸能進(jìn)入肝臟代謝，參與肌肉、脾臟、心臟和腦內(nèi)代謝[18]。腸球菌為人和動物腸道內(nèi)的正常菌群，但在一定條件下也是條件致病菌。韓豎霞等[19]的研究表明腸球菌屬是老年糖尿病患者尿路感染的病原菌。腸道中腸球菌屬含量與三酰甘油水平呈正相關(guān)，腸球菌屬占腸道總細(xì)菌的比例與高密度脂蛋白水平呈負(fù)相關(guān)[20]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)寵物的青少年腸道內(nèi)可能擁有較多的瘤胃球菌，這可能與其過敏和肥胖癥發(fā)生率低相關(guān)[21]。高脂飲食能夠增加回腸和結(jié)腸內(nèi)炎癥因子的表達(dá)，而腸道中毛螺菌/鏈球菌比例失調(diào)亦可引起代謝紊亂，與腸道炎癥密切相關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，兩組樣品菌群組成差異較大，觀察組的菌群多樣性指數(shù)、瘤胃球菌屬及毛螺菌屬豐度低于對照組，芽孢桿菌屬、梭菌屬、普雷沃氏菌屬、巨單胞菌屬、腸球菌屬豐度高于對照組(P<0.05)，提示MS患者與健康人群腸道菌群的多樣性及上述菌群豐度存在差異。

有研究表明，MS肥胖男性患者在接受來自體重正常人群的糞菌移植后，其三酰甘油水平迅速下降，證實了腸道菌群和脂代謝關(guān)系密切，且糞菌移植對能量代謝相關(guān)疾病可能有一定的療效[23]。在限制脂肪和碳水化合物飲食后，肥胖患者體質(zhì)量明顯下降，胰島素抵抗得到改善，腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[24]。而益生菌及益生元可通過改善腸道菌群紊亂來降低炎癥因子水平、提高胰島素敏感性，改善MS病情[25]，如加氏乳桿菌能降低肝臟三酰甘油水平及脂肪基因的表達(dá)，從而在一定程度上防止體重的增加[26]。此外，Zhong等[27]發(fā)現(xiàn)丹皮、赤芍可調(diào)節(jié)高脂飲食導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)，其作用類似于二甲雙胍。以上研究均提示，由糖脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)等引起的MS與腸道菌群的紊亂關(guān)系密切。

綜上所述，MS患者與健康人群腸道菌群的多樣性及特定菌群豐度存在差異，差異菌群集中在厚壁菌門(包括芽孢桿菌屬、梭菌屬)、普雷沃氏菌屬、巨單胞菌屬、腸球菌屬、瘤胃球菌屬、毛螺菌屬等，MS患者腸道菌群失調(diào)可能與MS的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。