（南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川南充637000）

泡菜具有悠久的歷史，不同國家、不同地區(qū)制作泡菜的工藝有差異，但大部分采用脆度較高的蔬菜，添加食鹽、香辛料，在避光、隔絕空氣的條件下，室溫條件自然發(fā)酵，不同地區(qū)的泡菜中也就具備不同種類和功能的益生菌，比如干酪乳桿菌[1-2]、乳酸鏈球菌[3]、植物乳桿菌等[4-5]。因此，從泡菜中篩選具有一定生理功能的益生菌也成為近年來的研究熱點(diǎn)。全永亮[6]從山東煙臺家庭自制的泡菜中分離得到1株分泌抑菌物質(zhì)的乳酸菌菌株。劉蘇萌等[7-8]從泡菜中分離出降解亞硝酸鹽的乳桿菌屬以及降解膽固醇的鏈球菌屬。Li F等[9]從泡菜中分離出具有緩解便秘的植物乳桿菌等。

重金屬鉛被人體吸入后幾乎都是形成不溶性的磷酸三鉛，沉積于骨骼中，還有少量在肝、腎和血液中[10]。鉛對人體的肝、腎、腦組織等產(chǎn)生毒作用，并且干擾免疫系統(tǒng)的功能。清除重金屬的方法中物理法效果不佳，化學(xué)法存在殘留，具有安全隱患，生物法是高效、環(huán)保、安全的[11]。益生菌作為生物吸附劑應(yīng)用于生物法去除重金屬是值得研究的，因此，篩選能夠降解鉛的益生菌也成為近年來研究的熱點(diǎn)，江南大學(xué)陳衛(wèi)教授的研究團(tuán)隊(duì)就篩選得到植物乳桿菌CCFM8661在體外對鉛離子具有優(yōu)良的吸附和耐受能力[12]。

本研究旨在以南充的本地特色泡菜為材料，設(shè)置降解鉛的能力大小為篩選因子，平板涂布法篩選出能夠降解鉛的乳酸菌，并且對其進(jìn)行耐受鉛的能力大小以及產(chǎn)酸的測定、體外模擬腸道環(huán)境進(jìn)行的耐酸和耐膽鹽能力的測定，篩選出一株目標(biāo)菌，并對其進(jìn)行生化和分子鑒定，為重金屬鉛的生物降解法提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

泡菜：南充市高坪區(qū)江東農(nóng)貿(mào)市場及小龍鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場。

MRS培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨 10.0 g、牛肉浸粉 5.0 g、酵母浸粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、磷酸二氫鉀2.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1 L，pH值調(diào)至6.2，固體培養(yǎng)基另加18.0 g瓊脂，121℃滅菌25 min。

1.2 主要試劑

鉛單元素標(biāo)液（Pb2+，1 000 μg/mL）：中國計(jì)量科學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：北京百泰克生物技術(shù)有限公司；溴甲酚紫：上海邁坤化工有限公司；牛膽鹽：上海博微生物科技有限公司；乙酸鈉、硫酸鎂：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.3 儀器

SHP-180生化培養(yǎng)箱：金壇市杰瑞爾電器有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；UPY-111-102優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：四川優(yōu)普超純科技有限公司；722N紫外-可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；AAnalyst 400原子吸收分光光度計(jì)：美國Perkin Eimer公司。

2 方法

2.1 原料預(yù)處理

將市購的泡菜在無菌條件切碎，在無菌條件下混合泡菜汁液并在組織搗碎機(jī)中打成漿液，取10 g泡菜漿液，備用。

2.2 平板初篩

采用平板涂布法，用含有1%的無菌生理鹽水稀釋梯度泡菜漿液至100倍，分別吸取每個稀釋度樣品100 μL，在含有0.1%溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，在36℃下倒置恒溫培養(yǎng)48 h，待其長出單菌落，進(jìn)行劃線分離，連續(xù)分離純化3次，將所得菌株進(jìn)行編號，進(jìn)行革蘭氏染色以及接觸酶試驗(yàn)，初步判斷是否為乳酸菌。

2.3 降解鉛能力的復(fù)篩

2.3.1 鉛濃度的測定

參照國標(biāo)GB 5009.12-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測定》火焰原子吸收法[13]，配制鉛標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度分別為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μg/mL，經(jīng)原子吸收分光光度計(jì)在283.3 nm波長處進(jìn)行吸光度測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中鉛濃度的測定，取5 mL樣品加入濃硝酸進(jìn)行消解至無色，再用超純水定容至50 mL，利用原子吸收分光光度計(jì)在283.3 nm波長處進(jìn)行吸光度測定。

2.3.2 降解鉛的能力復(fù)篩

將平板初篩得到的單菌落挑取至25 mL MRS液體培養(yǎng)基中，36℃恒溫靜置培養(yǎng)36 h，在600 nm波長處測定OD值，并將所有菌液稀釋至相同濃度。以3%接種量接入30 mL含10 μg/mL鉛的MRS培養(yǎng)液，24 h后用火焰原子吸收分光光度法測定鉛的含量。根據(jù)初始加入的10 μg/mL的量計(jì)算重金屬鉛的降解率。以不接種菌的培養(yǎng)基（含等量鉛）為對照。

2.3.3 耐受鉛的能力的測定

將復(fù)篩的單菌落活化，接種到鉛濃度分別為10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL MRS 液體培養(yǎng)基，36℃靜置培養(yǎng)24 h，測定活菌數(shù)。相同條件下，將活化的菌接種至不含鉛的MRS液體培養(yǎng)基為對照，以活菌數(shù)的百分比來表示耐受鉛的能力大小。

鉛的耐受能力/%=添加鉛的活菌數(shù)/對照的活菌數(shù)×100

2.4 產(chǎn)酸能力的測定

將二次活化的菌株接種2%到MRS液體培養(yǎng)基中，36℃靜置培養(yǎng)24 h，每隔4 h測量菌液的pH值[14]。

2.5 耐酸及耐膽鹽能力的測定

為了在體外模擬小腸環(huán)境，對篩選的菌株進(jìn)行耐酸和耐膽鹽試驗(yàn)，參照Liong和郭翔等方法[15-16]。

2.6 篩選菌株的生化鑒定

對篩選出降解鉛的能力較強(qiáng)的乳酸菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生化鑒定[17]。

2.7 16SrDNA分子鑒定

將篩選出的乳酸菌提取基因組DNA，具體方法參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書。以提取的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，再將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序完成后，進(jìn)行序列的同源性比對，再結(jié)合生化鑒定結(jié)果進(jìn)一步確定菌種。

2.8 數(shù)據(jù)處理

本文采用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statis－tics 19進(jìn)行結(jié)果處理及統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 平板初篩

平板初篩3次，劃線分離獲得純的菌株44株，編號分別為PC1～PC44，革蘭氏染色結(jié)果顯示所有菌株都是革蘭氏陽性（G+），短桿狀或中長桿狀，接觸酶試驗(yàn)初步判定所有菌株都是乳酸菌。

3.2 降解鉛的能力的菌株復(fù)篩

3.2.1 鉛的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在283.3 nm波長處，利用火焰原子分光光度法測定配好的鉛的標(biāo)準(zhǔn)系列，以鉛的標(biāo)準(zhǔn)濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 鉛的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Lead standard curve

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.014 1x-0.000 1，擬合度R2=0.999 8，其中y為283.3 nm波長下的吸光值，x為鉛的濃度（μg/mL）。

3.2.2 降解鉛的能力的復(fù)篩結(jié)果

將初篩所得44株菌根據(jù)2.3.2所述的方法進(jìn)行復(fù)篩，比較分析各株乳酸菌降解鉛的能力，選擇降解率在8%以上的進(jìn)行分析，如表1所示。

表1 乳酸菌對鉛的降解率Table 1 The degradation rate of lead by lactic acid bacterias

表1顯示出篩選出來對鉛的降解率在8%以上的9株乳酸菌各自的降解率，其中PC12具有最高的降解能力，達(dá)到27.67%，其次是菌株P(guān)C31，具有22.38%的降解率。降解率在10%以上的6株乳酸菌分別為：PC2、PC12、PC31、PC35、PC37、PC38，由此可見，復(fù)篩的乳酸菌都有降解重金屬鉛的能力。

3.2.3 耐受鉛的能力的測定結(jié)果

將復(fù)篩的降解鉛的能力最強(qiáng)的PC12和PC31進(jìn)行耐受鉛的能力的測定，以不同鉛濃度為橫坐標(biāo)，以活菌數(shù)的百分比為縱坐標(biāo)來表示耐受鉛的能力大小，如圖2所示。

圖2 PC12和PC31菌株耐受鉛能力Fig.2 The tolerance of strain PC12 and PC31 to lead

由圖2可見，篩選出降解鉛的能力較強(qiáng)的兩株乳酸菌PC12和PC31都能耐受高濃度的鉛，其中PC12在含有相同鉛濃度的MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)更多，耐受能力相比PC31略強(qiáng)。

3.3 產(chǎn)酸能力的測定結(jié)果

將篩選所得降解鉛的能力最強(qiáng)的PC12和PC31進(jìn)行產(chǎn)酸能力的測定，其結(jié)果如圖3。

圖3 PC12和PC31菌株的產(chǎn)酸能力Fig.3 The acid production capacity of PC12 and PC31

由圖3可以看出，復(fù)篩的PC12和PC31兩株乳酸菌在0～12 h期間的pH值下降較為明顯，PC12從初始的6.20下降到4.36，PC31從初始的6.20下降到4.53，這時(shí)菌株處于對數(shù)生長期，產(chǎn)酸速度較快。PC12和PC31在12 h至16 h期間，pH值下降緩慢，16 h之后，PC12和PC31的pH值基本穩(wěn)定在3.95～4.15，菌株處于生長的穩(wěn)定期，產(chǎn)酸能力較慢?？傮w來看，菌株P(guān)C12相比PC31產(chǎn)酸能力略強(qiáng)。

3.4 耐酸和耐膽鹽能力

3.4.1 篩選菌株的耐酸性

將篩選的兩株乳酸菌接種在pH 2和pH 3的酸性環(huán)境中，36℃靜置培養(yǎng)24 h，根據(jù)乳酸菌的存活率測定出耐酸能力的強(qiáng)弱，PC12和PC31兩株菌的耐酸性強(qiáng)弱見表2。

表2 PC12和PC31的耐酸能力Table 2 The acid resistance of PC12 and PC31

由表2可以看出，從泡菜中篩選所得的兩株乳酸菌PC12和PC31在強(qiáng)酸性環(huán)境中依然可以較好生存，其中PC12相比PC31在強(qiáng)酸性的環(huán)境存活率略高，這與PC12產(chǎn)酸能力略強(qiáng)存在一定的關(guān)系。PC12和PC31菌株分別在pH2環(huán)境中的存活率低于pH3環(huán)境，在一定程度上，酸性越強(qiáng)也會抑制乳酸菌自身的生長。

3.4.2 篩選菌株的耐膽鹽能力

將篩選出的兩株乳酸菌PC12和PC31分別進(jìn)行耐膽鹽的測定，篩選出降解PC12和PC31耐膽鹽能力的強(qiáng)弱見表3。

表3 篩選菌株的耐膽鹽能力Table 3 The bile salt tolerance of screening strains

篩選所得的兩株菌PC12和PC31在MRS培養(yǎng)基和添加了0.3%膽鹽的MRS養(yǎng)基中生長速度相近。當(dāng)A600達(dá)到0.3，PC12在MRS培養(yǎng)基中生長所需時(shí)間為3.78 h，在含0.3%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中所需時(shí)間為3.54 h，比MRS快0.24 h，表明添加0.3%膽鹽對PC12生長沒有抑制作用，并且有一定的促進(jìn)作用。PC31在MRS培養(yǎng)基中所需時(shí)間為4.12 h，在0.3%膽鹽的MRS中所需4.20 h，比MRS培養(yǎng)基慢0.08 h，表明膽鹽對PC31生長有一定的抑制作用。

3.5 目標(biāo)菌株的鑒定

綜合降解鉛的能力、產(chǎn)酸能力以及耐酸和耐膽鹽能力強(qiáng)弱，將篩選所得PC12菌株作為目標(biāo)菌株進(jìn)行鑒定。

3.5.1 目標(biāo)菌株的形態(tài)學(xué)特征

對PC12進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征觀察，菌落表面微微凸起、濕潤、邊緣光滑整齊，革蘭氏染色顯示成陽性，短桿狀，多數(shù)成對出現(xiàn)，結(jié)果見圖4。

3.5.2 目標(biāo)菌株的生化鑒定結(jié)果

對篩選所得目標(biāo)菌株P(guān)C12進(jìn)行生化鑒定，其結(jié)果如表4所示。

圖4 PC12的平板劃線及革蘭氏染色Fig.4 The plate streaking and gram staining of PC12

表4 PC12生化鑒定結(jié)果Table 4 The biochemical identification results of PC12

對PC12進(jìn)行一系列生理生化試驗(yàn)，結(jié)果表明與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及乳酸菌分類鑒定及方法對照，初步判定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

3.5.3 16SrDNA分子鑒定

以目標(biāo)菌株P(guān)C12的DNA為模板，以細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對，顯示與植物乳桿菌Lactobacillus plantarum同源性高達(dá)99%，確定該菌株為植物乳桿菌。

4 結(jié)論與討論

本研究以南充的本地泡菜為材料，平板涂布法初篩獲得44株乳酸菌，以降解重金屬鉛的能力大小為復(fù)篩指標(biāo)，獲得兩株降解鉛的能力較高的PC12和PC31，綜合耐受鉛的能力測定、產(chǎn)酸能力、耐酸和耐膽鹽能力測定，選擇PC12作為目標(biāo)菌株進(jìn)行生化以及16SrDNA分子鑒定，確定該菌株為植物乳桿菌。

研究表明，乳酸菌降解重金屬的機(jī)理主要是吸附作用，本研究選擇降解重金屬鉛的能力作為復(fù)篩因子，選擇的是在MRS培養(yǎng)基中添加的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，篩選菌株的生長環(huán)境相對簡單，降解效率可能會與復(fù)雜環(huán)境下有一定差異。對復(fù)篩的兩株菌PC12和PC31進(jìn)行耐受鉛的能力測試、產(chǎn)酸能力、耐酸和耐膽鹽能力測試，結(jié)果顯示，其耐受鉛的能力依然相差不大，但是其產(chǎn)酸、耐酸和耐膽鹽顯示出明顯的差異。菌株P(guān)C12均比PC31性能強(qiáng)，不同的菌株之間，其生理功能存在差異主要源于基因組水平存在差異[18]。