朱淼，嚴(yán)凱，翁貴英，王緒英

（六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州六盤水553004）

紅花龍膽（Gentiana rhodantha Franch）為苗族常用藥材，在苗藥中被稱為“銳定謀”，是龍膽科龍膽屬多年生草本植物，同時(shí)也是2015版藥典中新增品種[1-2]。紅花龍膽主要分布于我國(guó)西南地區(qū)各省，全草可入藥，具有清熱利濕，消炎解毒的功效，被其生長(zhǎng)地區(qū)的當(dāng)?shù)鼐用裼糜谥委煼窝住⒅夤苎?、眼結(jié)膜炎等炎癥以及痢疾、肺結(jié)核等感染，同時(shí)外用時(shí)還可治療癰癤瘡瘍，燒燙傷等癥，具有廣泛的藥理作用。

目前對(duì)于紅花龍膽化學(xué)成分報(bào)道較少。羅君等[3]通過(guò)超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)紅花龍膽95%醇提物的正丁醇萃取部位進(jìn)行分析，共鑒定出環(huán)烯醚萜類、酚酸類、黃酮類、三萜類、苯甲酸碳苷類、吡喃酮類等共計(jì)33種化合物；陳云課題組[4]運(yùn)用硅膠等多種色譜柱對(duì)紅花龍膽化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，得到并鑒定出10種酚類化合物和6種三萜類化合物共計(jì)16種物質(zhì)。這些研究結(jié)果表明，紅花龍膽中主要的化學(xué)成分為萜類化合物和多酚類化合物。除了紅花龍膽的化學(xué)成分外，對(duì)于其生物活性也有所研究。方玉梅等[5]發(fā)現(xiàn)紅花龍膽對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑制活性，而王飛清等[6]發(fā)現(xiàn)紅花龍膽對(duì)肺炎鏈球菌引起的肺炎具有防治作用。Kim課題組[7]研究發(fā)現(xiàn)，紅花龍膽可通過(guò)其中的Rhodanthpyrone A和Rhodanthpyrone B兩種化合物發(fā)揮抗炎作用，兩種物質(zhì)能夠降低RAW 264.7細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中一氧化氮合酶及環(huán)氧合酶2的表達(dá)，同時(shí)令炎癥細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)下調(diào)，并抑制了NF-κβ途徑。Xu等[8]的研究發(fā)現(xiàn)紅花龍膽中含有抑制乙酰膽堿酯酶的化學(xué)成分，提示紅花龍膽具有抗阿爾茨海默癥活性。

鑒于現(xiàn)在對(duì)紅花龍膽的生物活性研究報(bào)道較少，說(shuō)明非常有必要對(duì)這種新增進(jìn)入藥典的藥材做進(jìn)一步研究，尤其目前對(duì)于紅花龍膽的抗氧化活性尚無(wú)報(bào)道。本研究針對(duì)紅花龍膽中一類主要的化學(xué)成分多酚類化合物進(jìn)行提取，并利用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)考察多酚提取物的抗氧化活性，為紅花龍膽進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)參考，同時(shí)為闡明紅花龍膽的抗氧化性提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花龍膽采于六盤水市，六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植科教研室鑒定為龍膽屬植物紅花龍膽（Gentiana rhodantha Franch）的干燥莖葉；雙氧水：德州格利潔消毒制品有限公司；酒石酸鉀鈉、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、水楊酸、L-抗壞血酸、硫酸亞鐵、沒(méi)食子酸（均為國(guó)產(chǎn)分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(jī)（SB-800DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；中藥粉碎機(jī)（DFT-200）：海新諾儀器設(shè)備有限公司；電子天平（AUW120D）：日本島津公司；紫外分光光度計(jì)（UV-2100）：北京東西分析儀器有限公司；烘箱（HH-2A型）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

取新鮮紅花龍膽莖葉自然風(fēng)干后，再放置60℃烘干至恒重，粉碎過(guò)40目篩，待用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

多酚含量測(cè)定采用酒石酸亞鐵顯色法[9]。取0.1250 g沒(méi)食子酸對(duì)照品加水定容至250 mL，配置成濃度為0.5 mg/mL 的對(duì)照品溶液，取該對(duì)照品 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 加入到 10 mL 容量瓶中，加水補(bǔ)至2 mL，再分別添加2 mL酒石酸亞鐵溶液后，用pH7.5的磷酸鹽緩沖液補(bǔ)齊至10 mL，放置室溫10 min后，在540 nm處測(cè)定吸光度。得到線性回歸方程y=14.13x-0.021 1（R2=0.998 5）。

多酚得率/%=提取液中多酚質(zhì)量/莖葉干粉質(zhì)量×100

1.3.3 樣品多酚提取流程

稱取0.5 g待測(cè)樣品，加入乙醇溶液，混勻后在超聲功率800 W的條件下進(jìn)行多酚提取。將提取液以3 000 r/min離心5 min取上清。吸1 mL上清液至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加水補(bǔ)至2 mL，再添加酒石酸亞鐵溶液2 mL，用pH7.5的磷酸鹽緩沖液定容至10 mL后混勻，靜置10 min，于540 nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在料液比 1：60（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%時(shí)，檢測(cè)超聲時(shí)間為 10、20、30、40、50、60 min 時(shí)，紅花龍膽的多酚得率；在超聲時(shí)間 30 min，料液比 1：60（g/mL），檢測(cè)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%時(shí)，紅花龍膽的多酚得率；在超聲時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%時(shí)，檢測(cè)料液比為 1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1 ∶80、1 ∶90（g/mL）時(shí)，紅花龍膽的多酚得率。以上所有條件保持超聲功率800 W不變。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素（時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)）試驗(yàn)結(jié)果，選取每個(gè)因素中對(duì)多酚得率影響較大的3個(gè)數(shù)值作為試驗(yàn)因素，以多酚類化合物得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理優(yōu)化紅花龍膽的多酚提取工藝，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design

1.3.6 抗氧化試驗(yàn)

將紅花龍膽多酚提取物稀釋成不同濃度后，進(jìn)行羥自由基清除率[10]與超氧陰離子自由基清除率[11]檢測(cè)，并以VC做陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)多酚類化合物得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)總多酚得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)總多酚得率的影響Fig.1 Effect of exetraction time on the yield of polyphenols

由圖1可知，當(dāng)超聲時(shí)間在30 min時(shí)，紅花龍膽的多酚得率達(dá)到最大，超過(guò)30 min后，得率有所下降，可能是由于隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，一些熱敏組分被破壞，導(dǎo)致多酚析出量有所下降。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚類化合物的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of polyphenols

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，多酚類化合物的得率達(dá)到最大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加，多酚得率有所下降，可能是此濃度下的有機(jī)溶劑與紅花龍膽中的多酚極性比較接近，導(dǎo)致多酚類化合物析出量較多。

2.1.3 料液比對(duì)多酚類化合物得率的影響

料液比對(duì)多酚得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polyphenols

由圖 3 可知，在料液比 1 ∶60（g/mL）時(shí)，紅花龍膽多酚得率基本達(dá)到最大。隨著液體體積的增大，多酚得率基本不再增加，說(shuō)明在料液比1∶60（g/mL）時(shí)紅花龍膽中多酚類化合物基本完全溶解。

2.2 響應(yīng)面法分析結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立與分析

以紅花龍膽多酚得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results

得到各因素（多酚得率R、提取時(shí)間A、乙醇體積分?jǐn)?shù)B、料液比C）擬合回歸方程：R=-45.454 00+0.257 80A+0.635 50B+1.036 85C+1.275 00×10-3AB-4.750 00×10-4AC-3.750 00×10-4BC-4.942 50×10-3A2-6.592 50×10-3B2-8.542 50×10-3C2。

根據(jù)上述回歸模型得到各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果和方程方差分析結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance of each term in the response surface regression model

該回歸模型具有極顯著差異（P=0.000 6＜0.01），其失擬項(xiàng)不顯著，表明該回歸模型與實(shí)測(cè)值之間具有較好的擬合度，其中A2、B2、C2對(duì)紅花龍膽多酚得率有極顯著的影響，C對(duì)紅花龍膽多酚得率有顯著影響。3個(gè)因素對(duì)紅花龍膽多酚得率的影響依次為C＞B＞A，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。

2.2.2 回歸模型響應(yīng)面分析

通過(guò)Design-Expert對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了三元二次回歸擬合后得到響應(yīng)面圖，如圖4所示，AB、AC、BC響應(yīng)面坡度平緩，說(shuō)明他們之間的交互作用對(duì)紅花龍膽的多酚得率影響較弱。

圖4 各交互因素對(duì)多酚類化合物得率的影響Fig.4 Response surface plots of each pair of interaction factors on the extraction rate of polyphenols

2.2.3 工藝優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面分析后的優(yōu)化工藝為：提取時(shí)間29.62 min，乙醇體積分?jǐn)?shù) 49.39%，料液比 1∶58.78（g/mL）時(shí)，紅花龍膽多酚得率為4.53%。為便于操作，將最優(yōu)工藝修正為：提取時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)49%，料液比1∶59（g/mL），在此條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到多酚的實(shí)際得率為4.61%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.26%，與預(yù)測(cè)值4.53%的相對(duì)誤差為1.74%。

2.3 抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果

羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 紅花龍膽多酚提取物和VC的羥自由基清除率Fig.5 Hydroxyl radical-scavenging activity of Gentiana rhodantha Franch and VC

圖6 紅花龍膽多酚提取物和VC的超氧陰離子自由基清除率Fig.6 Superoxide radical scavenging activity of Gentiana rhodantha Franch and VC

由圖5和圖6可知，隨著紅花龍膽多酚含量的不斷增加，提取物對(duì)羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)，其線性擬合方程分別為：y（羥自由基）=186.7x-10.492，R2=0.995 7；y（超氧陰離子自由基）=187.85x-9.097 9，R2=0.996 1，均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其IC50分別為0.324 mg/mL和0.315 mg/mL。

3 結(jié)論

紅花龍膽作為一種地區(qū)性的民族用藥，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)了多種與之相關(guān)的復(fù)方配伍劑，本試驗(yàn)通過(guò)超聲輔助提取其多酚類化合物，并采用響應(yīng)曲面試驗(yàn)確定其多酚提取的最佳工藝，并考察所得提取物的羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力。結(jié)果表明，最佳提取工藝為：在提取時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)49%，料液比1∶59（g/mL）的條件下，紅花龍膽多酚得率為4.61%。其對(duì)羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率的IC50分別為0.324mg/mL和0.315mg/mL，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。