趙國春，扣澤華，孔令聰,2，劉立英

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林省新獸藥研發(fā)與創(chuàng)制重點實驗室，吉林 長春 130118；3.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營口 115009）

防御素是抗菌肽中的一個大家族，具有高效、廣譜的不同于抗生素的獨特抗菌機(jī)制。根據(jù)二硫鍵位置的不同其可分為三個不同亞家族：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。其中β-防御素通常含有3對分子內(nèi)二硫鍵，大多是由38～42個氨基酸殘基組成的陽離子雙親分子，相對分子質(zhì)量為2～6ku。β-防御素除了在呼吸道、腸道和骨髓上皮組織中有表達(dá)外，在結(jié)膜和胎盤等其他組織中也發(fā)揮著宿主防御作用。此外，相關(guān)報道已證實，β-防御素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、念球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和假絲酵母等具有較好的抗菌活性，同時在抗病毒和先天免疫方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的活性?？傊?，β-防御素的抗菌、抗病毒性能對于科研和生產(chǎn)具有重要意義，已成為影響生物機(jī)體健康狀態(tài)的重要抗菌肽之一。

1 β-防御素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

防御素亞家族成員是帶有陽離子且富含半胱氨酸的抗微生物肽，具有獨特的六個半胱氨酸殘基的特征性片狀結(jié)構(gòu)，依靠分子內(nèi)部的三個二硫鍵維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，六個半胱氨酸殘基之間的鍵合及其鍵合模式為C1-C5，C2-C4，C3-C6。該類肽由三條反向平行鏈組成，它們以一種“反式”排列與二硫鍵相連。盡管發(fā)現(xiàn)二硫鍵對其抗菌活性并不重要，但除去二硫鍵會導(dǎo)致非結(jié)構(gòu)化肽水解，穩(wěn)定性降低。天然防御素具有半衰期短且不穩(wěn)定的特點，經(jīng)過化學(xué)修飾后能彌補(bǔ)其不足，而且在高溫條件下其性質(zhì)仍能保持穩(wěn)定且生物活性不受影響[1-2]。β-防御素的典型特征是能夠折疊成各種二級結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)角、延伸結(jié)構(gòu)和其他排列[3]。

2 β-防御素的合成和釋放

β-防御素在上皮細(xì)胞中合成。大多數(shù)β-防御素基因具有兩個外顯子，一個外顯子編碼富含疏水性亮氨酸信號序列的前原肽，另一個外顯子編碼成熟肽。當(dāng)哺乳動物防御素雙外顯子基因轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA時，外顯子1形成5'UTR區(qū)和具有編碼信號肽的mRNA區(qū)，初級翻譯產(chǎn)物在N-端具有非活性前體肽和信號序列。外顯子2形成3'UTR和編碼成熟肽的mRNA區(qū)，而成熟肽是由前體片段切割形成的，它們在N末端具有信號序列，在C末端具有短前體片段[4]。

通常情況下，微生物信號、發(fā)育信號、細(xì)胞因子和某些神經(jīng)內(nèi)分泌信號以組織特異性的方式調(diào)節(jié)防御素的合成和釋放[5]。β-防御素最早從牛上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中分離得到，隨后在各種脊椎動物身上都有發(fā)現(xiàn)。骨髓是產(chǎn)生成年動物中性粒細(xì)胞的主要組織，骨髓β-防御素mRNA合成的總體特征類似于中性粒細(xì)胞α-防御素的基因轉(zhuǎn)錄模式[6]。β-防御素儲存在與吞噬泡融合的中性粒細(xì)胞致密顆粒中。在牛中性粒細(xì)胞致密顆粒中有三種典型的中性粒細(xì)胞β-防御素：BNBD-4，BNBD-12和 BNBD-13，這三種中性粒細(xì)胞β-防御素的mRNAs在骨髓中含量最為豐富，在骨髓生成早期完成BNBD-4的合成，而BNBD-12僅存在于新的致密顆粒中，與組織蛋白酶前體一同分泌[7]。β-防御素前體半衰期非常短，初級翻譯產(chǎn)物迅速轉(zhuǎn)化為成熟的β-防御素。中性粒細(xì)胞在骨髓中成熟并聚集顆粒庫，停止顆粒合成后富含防御素的初級顆粒與吞噬泡發(fā)生融合，在吞噬泡中產(chǎn)生高濃度的防御素[8]。當(dāng)其被釋放到血液外周循環(huán)時β-防御素已經(jīng)完成合成。

3 β-防御素的抗微生物特性

防御素作為先天免疫反應(yīng)的成員，參與體內(nèi)各種抗菌反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受細(xì)菌、真菌的侵害。試驗證明，大多數(shù)防御素在一定條件下具有廣譜抗菌活性，尤其對細(xì)菌和真菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，在抗病毒方面也顯示出獨特的優(yōu)勢。

3.1 β-防御素的抗細(xì)菌作用

Chen等人為了解各種抗菌素之間是否存在協(xié)同作用而進(jìn)行了研究，他們發(fā)現(xiàn)，hBD-1、2、3（human βdefensins），ll-37（組織蛋白酶 ll-37）和溶菌酶之間的不同組合對處在中性環(huán)境中的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有協(xié)同或疊加抗菌作用。在酸性環(huán)境中，hBDs、ll-37和溶菌酶與金黃色葡萄球菌的協(xié)同作用得到增強(qiáng)。相比之下，在酸性環(huán)境中上述抗菌劑對大腸桿菌的抗菌活性主要體現(xiàn)為疊加而非協(xié)同作用[9]。Midorikawa K等人[10]也開展了相似研究，發(fā)現(xiàn)hBD-2、3和Cap18在角質(zhì)形成細(xì)胞中同樣具有協(xié)同作用，只是β-防御素與Cap18的協(xié)同作用表明，這兩種肽對金黃色葡萄球菌的作用方式，其表達(dá)模式存在差異。然而與防御素具有廣譜殺菌活性相悖的是，Wang等人[11]在研究人β-防御素對乳酸菌的抗菌作用時發(fā)現(xiàn)，hBD-1、2、3對實驗室三種乳酸菌菌株沒有明顯的殺滅作用。由此可以得出，hBDs能夠作為人體的安全抗菌劑，且不會干擾腸道共生菌平衡。在對特應(yīng)性皮炎（AD）的研究中，發(fā)現(xiàn)AD是一種與金黃色葡萄球菌有關(guān)的慢性炎癥性皮膚病，此為預(yù)防金黃色葡萄球菌介導(dǎo)的AD提供了潛在的治療途徑[12]。但另一份研究表明，AD發(fā)病與hBD-1缺陷有關(guān)。AD損傷組織HBD-1中5′區(qū)的CpG3和CpG4位點的甲基化，導(dǎo)致啟動子活性降低，并影響hBD-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，且甲基化特征將成為治療因hBD-1缺陷引起的角質(zhì)層受損的有效靶點[13]。有研究團(tuán)隊利用畢赤酵母和枯草桿菌的密碼子分別構(gòu)建表達(dá)純化重組豬防御素2（rpBD-2），pBD2/CP1[防御素 2（pBD-2）和抗菌肽 cecropin P1（CP1）]融合肽，結(jié)果表明，其表達(dá)產(chǎn)物均能對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抗菌活性。在豬飼料中添加重組枯草桿菌，能顯著促進(jìn)仔豬生長，降低仔豬腹瀉發(fā)生率。通過重組細(xì)菌表達(dá)的抗菌肽有望成為一種新型抗菌藥物[14-15]。也有團(tuán)隊利用Tol-2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因雞系過表達(dá)禽防御素-3（AvbD3），以減少家禽產(chǎn)品上的細(xì)菌生長，提高雞的先天免疫能力[16]。

3.2 β-防御素的抗真菌作用

β-防御素除了對體內(nèi)外細(xì)菌具有抗菌活性外，對真菌同樣具有抗菌活性。目前對于β-防御素抗真菌活性的研究主要集中在念珠菌。念珠菌是一種條件致病菌，寄生在人體黏膜上，當(dāng)宿主免疫力下降時會導(dǎo)致其過度生長。Tomalka等人[17]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠β-防御素-1（mBD-1）對黏膜念珠菌感染的控制非常重要，并且在先天性炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，mBD-1能通過增強(qiáng)白細(xì)胞浸潤和炎癥基因調(diào)控來調(diào)節(jié)宿主免疫力。此外，hBD-1、2、3已被證實對念珠菌具有殺菌活性[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，由hBD-3羧基端15個氨基酸所組成的合成肽（HBD3-C15）可通過增加細(xì)胞膜通透性清除白色念珠菌。該合成肽還能作為治療復(fù)發(fā)性根尖周炎的根管內(nèi)藥物[20-21]。

3.3 β-防御素的抗病毒作用

防御素抗病毒活性的機(jī)制較復(fù)雜，其隨特定肽、細(xì)胞、病毒類型的不同而不同；且防御素在體內(nèi)發(fā)揮抗病毒活性時常常是多種類型相互協(xié)同。最新的試驗發(fā)現(xiàn)，hBD-3對VV有很強(qiáng)的抗病毒活性。然而AD患者皮膚中的hBD-3生成不足，hBD-3缺乏會增加AD患者對系統(tǒng)性VV感染的敏感性[22-23]。HIV病毒作為一種攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒，它主要攻擊人體淋巴細(xì)胞，造成機(jī)體免疫功能喪失。對于HIV病毒的防治一直是一個棘手的問題。Qui?ones-Mateu等[24]研究了β-防御素對HIV病毒的抗病毒活性。在正常人口腔上皮細(xì)胞中，HIV-1可誘導(dǎo)hBD-2、3的mRNA表達(dá)（重組hBD-1無抗病毒活性），其表達(dá)分別比常規(guī)表達(dá)高4～78倍，能通過與病毒直接發(fā)生作用以及調(diào)節(jié)CXCR4受體來阻斷HIV-1復(fù)制。有人在研究hBD-2在體內(nèi)外促進(jìn)抗病毒免疫的能力時發(fā)現(xiàn)，與中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）棘突蛋白（S-RBD）受體結(jié)合的hBD-2能提高抗病毒和原代免疫誘導(dǎo)分子的表達(dá)水平，促進(jìn)白細(xì)胞趨化因子表達(dá)增加，增強(qiáng)SRBD特異性中和抗體應(yīng)答，此為hBD-2能夠作為一種有效的抗病毒疫苗佐劑提供了理論依據(jù)[25]。Crack等人對hBD-2的研究發(fā)現(xiàn)，外源hBD-2可抑制水痘帶狀皰疹病毒（VZV）的胞內(nèi)復(fù)制，在體內(nèi)的特異性抗體能阻斷其抗病毒作用[26]，而hBD-2衍生物會不會出現(xiàn)不一樣的情況，這需要進(jìn)一探究?？傊?，β-防御素在抗病毒方面存在巨大潛力，其后續(xù)研究有望帶來新的突破。

4 總結(jié)與展望

β-防御素作為一種重要的陽離子肽，是生物免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)因子，同時對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、病毒以及真菌都具有一定的活性。根據(jù)抗菌肽（包括β-防御素）的殺菌活性機(jī)制差異，已經(jīng)提出數(shù)種抗菌模型，包括桶壁模型、地毯模型、環(huán)孔模型等，但目前針對β-防御素殺菌機(jī)制似乎只基于地毯模型，這難以解釋β-防御素在殺菌上的廣譜性，且對其肽分子在膜孔中的具體排列方式尚不清楚。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)種革蘭氏陽性和陰性菌的活性能被β-防御素在不同程度上抑制，但β-防御素針對真菌的殺菌活性似乎僅限于念球菌，尚未發(fā)現(xiàn)針對于其他真菌的報道。此外，β-防御素針對各類病毒諸如HSV、HIV、HPV和各類癌癥如前列腺癌、腎癌等均有不同程度的抗病毒作用和免疫作用，有望成為診斷和治療疾病的標(biāo)志物。總之，抗菌肽一直是科學(xué)家的研究熱點，但針對β-防御素的研究才剛剛起步，尚有許多未知領(lǐng)域需要進(jìn)一步探索。

表1 β-防御素對細(xì)菌、真菌和腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理