靳 星，李文祎，馬 蓉

(1.隆堯縣醫(yī)院檢驗科，河北 邢臺 055350；2.北京大學(xué)人民醫(yī)院 檢驗科，北京 100044)

微小RNA(microRNA, miR)是屬于小分子非編碼RNA的一種，它們可以通過與靶基因的3'UTR結(jié)合抑制其表達。近來研究表明，miR的表達變化與多種疾病相關(guān)。在冠心病中，也存在多種上調(diào)或下調(diào)性變化的miR，它們共同參與該病的調(diào)控過程。miR-16是一種廣泛表達的miR，血漿中也可檢測到該miR的表達。研究證實，miR-16的表達在多種疾病，如腫瘤、心肌肥厚、腦中風(fēng)等[1-3]。在心肌肥厚過程中，miR-16的表達下調(diào)，并因此促進靶基因細胞周期蛋白(cyclin)D1、D2、E1表達的上調(diào)，加重心肌肥厚[3]。然而，miR-16在血管平滑肌中的作用尚不清楚，本研究分別通過檢測冠心病患者血漿miR-16的表達變化，探討該miR與冠心病的關(guān)系，并通過研究該miR對血管平滑肌增殖的影響初步探討該miR的作用機制，旨在為冠心病的診斷、治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 隨機選取在2016年9月至2017年10月于隆堯縣醫(yī)院心內(nèi)科住院并經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心病患者43例，男30例，女13例，年齡(65.8±11.3)歲；對照組為同期經(jīng)心電圖、超聲心動圖等檢測排除心臟疾病，來我院體檢的健康人49例，，男23例，女26例，年齡(60.4±12.8)歲。

1.2樣品采集 各組研究對象均抽取清晨空腹外周靜脈血4 ml，并收集于EDTA-K2抗凝管中。采血后，迅速在4 ℃下以3 000 r/min離心，收集上層血漿，分裝于凍存管中，保存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3血漿miR提取及檢測 采用mirVana血漿miR提取試劑盒，按照使用說明加入線蟲Cel-miR-39類似物作為內(nèi)參，依據(jù)試劑盒的使用說明提取血漿總RNA。用NanoDrop檢測RNA濃度，經(jīng)過稀釋、濃度矯正后采用ABI公司microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將各樣品中miR-16和Cel-miR-39進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用TaqMan探針實時熒光定量PCR法檢測各樣品中miR-16及Cel-miR-39的Ct值，以miR-16與Cel-miR-39的相對Ct值表示miR-16在各樣品中的相對表達強度。按對照組miR-16的相對表達強度進行歸一化處理，觀察各組相對于對照組血漿miR-16的表達變化。

1.4細胞處理與活力檢測 將人臍靜脈血管平滑肌細胞傳代、細胞計數(shù)，并稀釋至100 000個細胞/ml的密度，迅速接種于96孔板，每孔100 μl細胞懸液。待細胞貼壁后將細胞培養(yǎng)液血清濃度降至0.1%，以同步化細胞周期。血清饑餓24 h后采用Lipofectamin 3000試劑分別將miR-16類似物及其陰性對照轉(zhuǎn)染平滑肌細胞。轉(zhuǎn)染后24 h在相應(yīng)的細胞中加入PDGF-BB(終濃度10 nmol/L)處理。轉(zhuǎn)染后48 h，觀察細胞狀態(tài)，并在每個孔中加入10 μl的CCK-8試劑，將96孔板再次放入細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出觀察細胞懸液顏色變化，放置于酶標(biāo)儀上并檢測450 nm處吸光度數(shù)值。各組的吸光度數(shù)值經(jīng)過歸一化處理后分析其變化情況，并以此表示各組細胞的細胞活力變化。

1.5靶基因檢測 將人臍靜脈平滑肌細胞接種于12孔板，采用Lipofectamin 3000試劑轉(zhuǎn)染細胞，48 h后收集各組細胞，并采用Western印跡檢測各組細胞中cyclin D1、cyclin D2和cyclin E1的表達強度。具體步驟如下：將各組細胞加入RIPA裂解液，低溫靜置、震蕩，充分裂解，并在4 ℃條件下以12 000 r/min進行離心。取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，采用BCA法進行蛋白定量。定量后，采用RIPA裂解液稀釋至2 μg/μl的工作液，加入5X上樣緩沖液之后，在100 ℃中加熱煮沸5 min。之后，迅速置于冰上降溫，短暫離心后將各組樣品加入到SDS-PAGE膠中進行電泳分離(濃縮膠80 V 30 min，分離膠120 V 60 min)。之后，將膠取出，置于電轉(zhuǎn)儀上進行恒流電轉(zhuǎn)膜(300 mA, 120 min)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取出NC膜，采用麗春紅工作液染色，并采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。封閉結(jié)束后，采用含有抗cyclinD1、cyclin D2、cyclin E1及GAPDH的一抗稀釋液(1∶1 000)于4 ℃搖床上緩慢孵育過夜。次日，采用TBST溶液漂洗4次，并用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h。采用TBST溶液再次漂洗4次后加入化學(xué)發(fā)光底物顯色。通過Quantity One軟件拍攝、記錄圖像并掃描各條帶的灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以上述蛋白與GAPDH灰度的比值計算其相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1冠心病患者血漿miR-16水平下調(diào) 為探討miR-16在冠心病患者中的變化，采用實時熒光定量PCR法檢測血漿標(biāo)本中該miR的變化。血漿miR-16的表達在冠心病患者中顯著下調(diào)(1.00±0.42 vs 0.75±0.23，P<0.05)，表明miR-16表達的下調(diào)可能與冠心病有關(guān), 見圖1。

圖1 血漿 miR-16 的表達強度 *與對照組比較P<0.05

2.2miR-16 對血管平滑肌增殖的調(diào)控作用 為探討 miR-16 對血管平滑肌增殖的作用，采用 CCK-8 法檢測過表達 miR-16 后血管平滑肌細胞增殖的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染 miR-16 類似物48 h后，血管平滑肌細胞的增殖活力顯著下降，是對照組的23.1%，見圖 2。在此基礎(chǔ)上采用血小板源生生長因子 PDGF-BB(50 ng/L)刺激血管平滑肌增殖，觀察到過表達 miR-16 類似物的血管平滑肌細胞增殖活力 是陰性對照組的53.8%，表明過表達 miR-16 后可部分對抗 PDGF-BB 誘導(dǎo)的細胞增殖，見 圖 2。采用Western印跡對其靶基因cyclin D1、D2及E1進行檢測，發(fā)現(xiàn)過表達miR-16后可顯著降低上述基因的表達，見圖3。

圖2 miR-16 對細胞增殖活力的影響 采用CCK-8檢測細胞的增殖活力

圖3 miR-16 對細胞周期蛋白表達的調(diào)控作用 采用蛋白印跡檢測過表達miR-16后血管平滑肌細胞中cyclin D1、D2及E1表達的變化(a)。進行灰度掃描后以GAPDH為內(nèi)參，計算各組相對表達強度(b)。**與對照組比較P<0.01

3 討 論

miR是一種細胞內(nèi)的小分子非編碼RNA，其長度大約為21～23 nt。目前的研究發(fā)現(xiàn)，miR參與了胞內(nèi)多種生物學(xué)過程的調(diào)控，如細胞周期及增殖、凋亡、自噬等[4-8]。初始的miR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物較長，經(jīng)胞內(nèi)酶切處理后形成成熟體的miR。這些miR可與其靶基因的3'UTR結(jié)合進而影響后者的表達。目前研究證實，miR主要發(fā)揮抑制靶基因表達的功能，在哺乳動物細胞中，3'UTR結(jié)合miR后主要通過抑制該靶基因的翻譯而影響其表達。miR是一種小分子調(diào)控分子，因此其可以較容易的從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外以及循環(huán)血中。相較于大多數(shù)RNA分子，miR由于分子量較小而具有較高的穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)移至循環(huán)血中時可以在較長時間穩(wěn)定存在。因此，循環(huán)血中的miR就有可能被遠隔部位的細胞重新攝取，并轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)?；谠撎匦?，循環(huán)血miR的檢測為疾病的診斷以及疾病發(fā)病的分子機制研究提供了新方法[9]。

目前研究表明，多種疾病如心血管疾病、腫瘤等，其患者循環(huán)血中特定類型的miR表達均可呈現(xiàn)顯著變化[10-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血漿miR-16表達水平呈顯著下調(diào)趨勢，由此提示該miR很可能在冠心病發(fā)病及進展過程中起到重要的調(diào)控作用。

miR-16是一種調(diào)控細胞周期的小分子非編碼RNA，其高表達可顯著抑制多種cyclins的表達，進而抑制細胞增殖[1, 17-20]。研究表明，在腫瘤細胞中，miR-16可負(fù)向調(diào)控cyclin D1、cyclin D2及cyclin E1的表達[3]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌細胞中過表達miR-16可顯著抑制該細胞增殖，并顯著下調(diào)cyclin D1、D2及cyclin E1的表達強度。血管平滑肌細胞過度增殖是冠狀動脈狹窄的病理機制之一。當(dāng)血管內(nèi)皮受到氧化應(yīng)激、炎癥損傷時，其功能紊亂，同時導(dǎo)致血管平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)換，即由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛?。分泌型的血管平滑肌細胞逐漸失去其原有的形態(tài)和功能，獲得細胞增殖、遷移、合成分泌的能力。發(fā)生表型轉(zhuǎn)換后的血管平滑肌細胞合成細胞外基質(zhì)成分的能力增加，進而加重血管的重塑和管腔狹窄。在本研究中，我們不僅發(fā)現(xiàn)在冠心病患者循環(huán)血中miR-16出現(xiàn)顯著降低，還發(fā)現(xiàn)該miR過表達后抑制了血管平滑肌細胞的增殖以及細胞周期蛋白cyclin D1、cyclin D2及cyclin E1的表達下調(diào)。由此提示，該miR很可能發(fā)揮了抑制冠心病的作用。通過分子生物學(xué)手段阻斷血管平滑肌細胞的增殖很可能是治療冠心病的有效策略。我們的研究表明， 過表達miR-16 后可顯著阻斷血管平滑肌細胞增殖，該過程很可能是通過靶向抑制細胞周期蛋白 cyclin D1、cyclin D2 及 cyclin E1所致。然而，本研究還存在一些局限性：首先，本研究中病例數(shù)目較少，需要在更大規(guī)模的人群中做相關(guān)分析；其次，本研究尚未在動物模型上做相關(guān)驗證，尚不能完全闡明miR-16對冠心病發(fā)展以及血管平滑肌細胞增殖的直接關(guān)系。因此，關(guān)于miR-16與冠心病之間的分子機制仍是今后研究的重點。

綜上所述，miR-16 是一種冠心病及血管平滑肌細胞增殖相關(guān) miR-16，其表達在冠心病患者中下調(diào)。該 miR可通過抑制多種細胞周期調(diào)控蛋白抑制血管平滑肌細胞的增殖，miR-16 很可能是冠心病防治的潛在靶點。