吳小利，邵玲，翟明賀，劉麗文(遼寧省人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)科，沈陽110016)

長孢洛德酵母菌(Lodderomyceselongisporus，L.elongisporus)是以Jacomina Lodder博士名字命名的一種酵母菌，于1952年首次被描述為Saccharomyceselongasporus[1]，曾被認為是念珠菌的一個分枝，但有研究表明其是一個不同的物種[2-3]。系統(tǒng)發(fā)育分析中長孢洛德酵母菌與近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、白念珠菌(C.albicans)、都柏林念珠菌(C.dubliniensis)和熱帶念珠菌(C.tropicalis)被劃分在一個分枝，是該分枝中唯一產(chǎn)生子囊孢子的物種[4]。2008年首次報道長孢洛德酵母菌引起人類菌血癥[5]，目前關(guān)于臨床感染的報道仍較少。由于該菌分離率低，形態(tài)易與其他酵母菌混淆，廣泛使用的鑒定方法Vitek 2和API 20C易發(fā)生誤判而影響抗真菌藥物的選擇，從而延誤患者的治療，增加患者負擔(dān)[6]。本研究通過從一位腎病患者透析液中檢出1株長孢洛德酵母菌，對該菌的微生物學(xué)特征、鑒定及藥物敏感性進行分析，以期提高臨床對于該菌的認識。

1 材料與方法

1.1菌株來源 菌株分離自2019年遼寧省人民醫(yī)院1例腹膜透析相關(guān)性感染的56歲男性患者。患者診斷依據(jù)2010年國際腹膜透析學(xué)會指南中關(guān)于腹膜透析相關(guān)性感染診斷標準[7]。患者入院第2天及第7天2次腹透液經(jīng)血培養(yǎng)增菌培養(yǎng)均獲得相同分離菌。光滑念珠菌ATCC 15126、近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258、白念珠菌ATCC 90028均購自上海寶錄生物公司，熱帶念珠菌編號201411菌株為國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心質(zhì)評菌株。

1.2主要試劑與儀器 血瓊脂培養(yǎng)基、科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基(沈陽彥程生物公司)，SDA、PDA培養(yǎng)基(天津金章公司)，革蘭染色液(快速)、抗酸染色液(珠海貝索公司)，SensititreTMYeastONE(美國Thermo公司)，真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶公司)；LEICA DM750光學(xué)顯微鏡(德國LEICA公司)，0.45%鹽水、Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)、真菌鑒定卡(Vitek?2 YST)(法國生物梅里埃公司)，質(zhì)譜樣本處理液、microflexTMLRF質(zhì)譜分析儀(Bruker Daltonics公司)。引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.3分離菌株的培養(yǎng)與鑒定 將分離菌在血平板、科瑪嘉顯色平板及PDA平板上35 ℃培養(yǎng)，分別觀察24 h、48 h、72 h、96 h菌落形態(tài)；取血平板上培養(yǎng)24 h菌落涂片并采用結(jié)晶紫染色和革蘭染色后觀察鏡下形態(tài)；取血平板上培養(yǎng)24 h菌落置于裝有0.5 mL新鮮血清試管中，35 ℃培養(yǎng)2 h，制作濕片鏡下觀察芽管形成情況，用白念珠菌ATCC 90028作對照；取血平板上培養(yǎng)48 h菌落于0.45%鹽水中制備3.0麥氏濁度單位菌懸液，采用Vitek?2 YST卡在Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進行鑒定；同時取血平板上培養(yǎng)48 h單個菌落涂布靶板，自然干燥后加入1 μL 70%甲酸覆蓋點樣孔，自然風(fēng)干后，加1 μL質(zhì)譜樣本處理液，自然風(fēng)干后上基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)儀進行鑒定并依據(jù)儀器說明進行結(jié)果判讀。

1.4基因序列分析 收集血平板上培養(yǎng)48 h菌落，按照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取。參照文獻[8]合成真菌通用引物，進行PCR擴增，引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′) 和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系30 μL，包括2×Taq plus mix 15 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳并對目的條帶進行回收(主要試劑：溶膠液、磁珠、ddH2O、80%乙醇)，采用Sanger法在ABI 3730XL設(shè)備上進行測序，由北京睿博興公司完成。將測序序列和GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析。

1.5聚類分析 建立分離菌長孢洛德酵母菌的數(shù)據(jù)庫，通過MALDI Biotyper 3.1軟件與白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、近平滑念珠菌5種常見酵母菌及庫內(nèi)已知的3株L.elongisporus進行聚類分析，得出系統(tǒng)樹狀圖。

1.6藥物敏感性分析 取SDA平板上培養(yǎng)24 h菌落并制備0.5麥氏濁度單位菌懸液，取20 μL菌懸液加入YeastONE真菌接種肉湯中混勻，真菌藥敏板每孔加入混勻后的YeastONE真菌接種肉湯100 μL，密封后于35 ℃培養(yǎng)箱中溫育24 h后進行結(jié)果判讀。

2 結(jié)果

2.1長孢洛德酵母菌培養(yǎng)特性、菌落形態(tài) 分離菌株在血平板和PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～96 h呈白色光滑菌落；在科瑪嘉顯色平板上培養(yǎng)24 h為白色小菌落，48～96 h逐漸顯色，最終呈藍綠色菌落。見圖1。血平板上生長24 h后經(jīng)芽管生成試驗未見芽管形成，革蘭染色和結(jié)晶紫染色鏡下呈現(xiàn)卵圓形孢子。長孢洛德酵母菌在科瑪嘉顯色平板上呈藍綠色菌落，顏色介于白念珠菌的淡藍綠色和暗藍、藍灰色的熱帶假念珠菌之間，與近平滑念珠菌、克柔念珠菌及光滑念珠菌的紫色系列明顯不同，見圖2。

注：a1～a4，為血平板；b1～b4，為科瑪嘉顯色平板；c1～c4，為PDA平板。

注：a，長孢洛德酵母菌；b，克柔念珠菌；c，近平滑念珠菌；d，光滑念珠菌；e，白念珠菌；f，熱帶念珠菌。

2.2Vitek 2和MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果 Vitek 2鑒定分離菌結(jié)果為無名念珠菌(C.famata)，MALDI-TOF MS鑒定分離菌為長孢洛德酵母菌(得分為2.10)。

2.3ITS rRNA基因序列分析結(jié)果 PCR擴增產(chǎn)物Sanger法測序長度為565 bp，將序列和GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，相似性排在前3位的均為L.elongisporus(登錄號：JN606251.1、KF959855.1和AY391845.1)，相似性分別為99.47%、99.46%和99.46%。

2.4聚類分析結(jié)果 所選6種酵母菌分為2類，其中長孢洛德酵母菌與白念珠菌、熱帶念珠菌以及近平滑念珠菌在同一分類中，而長孢洛德酵母菌與近平滑念珠菌在同一亞類中，白念珠菌與熱帶念珠菌在另外一個亞類中。分離菌與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中已知3株參考菌株在同一個聚類圖分枝中，但不是同一株菌。見圖3。

注：*為分離菌。

2.5藥敏結(jié)果 分離菌株對檢測藥物的MIC分別為米卡芬凈(0.015 μg/mL)、卡泊芬凈(0.03 μg/mL)、5-氟胞嘧啶(0.12 μg/mL)、泊沙康唑(0.03 μg/mL)、伏立康唑(0.03 μg/mL)、伊曲康唑(0.12 μg/mL)、阿尼芬凈(0.03 μg/mL)、氟康唑(0.5 μg/mL)、兩性霉素B(0.25 μg/mL)。

3 討論

長孢洛德酵母菌在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍綠色菌落，易與常見菌白念珠菌及熱帶念珠菌混淆，后二者在顯色培養(yǎng)基上分別呈現(xiàn)淡藍綠色和暗藍、藍灰色菌落。其中，長孢洛德酵母菌和白念珠菌的鑒別在無其他輔助設(shè)備使用的情況下可通過芽管試驗進行區(qū)分，光學(xué)顯微鏡下白念珠菌有芽管生長，而長孢洛德酵母菌無芽管生長。應(yīng)用Vitek或API鑒定時，長孢洛德酵母菌易被誤鑒定為近平滑念珠菌[5-6,9-11]，而本研究菌株經(jīng)Vitek鑒定為無名念珠菌。采用MALDI-TOF MS或測序進一步明確鑒別為長孢洛德酵母菌。但國內(nèi)很多中、小型微生物實驗室，由于MALDI-TOF MS或測序并未得到廣泛使用，僅根據(jù)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上的菌落顏色及Vitek表型鑒定結(jié)果，會造成對長孢洛德酵母菌的漏診及誤診。本研究通過MALDI Biotyper 3.1軟件對分離菌增建菌株庫，與5種酵母菌(包括白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、東方伊薩酵母)參考菌株進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)長孢洛德酵母菌與白念珠菌、熱帶念珠菌以及近平滑念珠菌在同一分枝中，這與Diezmann等[12]的發(fā)現(xiàn)相一致。通過MSP樹狀圖增建菌株庫可提高實驗室的檢測能力。

據(jù)文獻報道，長孢洛德酵母菌可引起人類血流感染[5,13]、導(dǎo)管相關(guān)血流感染[9,11]以及心內(nèi)膜炎[10]。本研究中患者3年前診斷為多發(fā)性骨髓瘤，經(jīng)數(shù)次化療，長期激素、免疫抑制劑及廣譜抗菌藥物治療導(dǎo)致患者免疫功能降低，機體處于免疫抑制及菌群失調(diào)狀態(tài)，進而造成真菌侵襲性感染的機會增加。該菌易感因素尚不明確，可能與惡性腫瘤、免疫抑制劑的長期使用、留置導(dǎo)管等有關(guān)。目前，國際上關(guān)于長孢洛德酵母菌的治療尚無統(tǒng)一方案，藥敏試驗方法也無統(tǒng)一標準及藥敏折點判讀標準。檢索報道的7例病例中4例死亡、3例治愈的患者雖治療方案不同，但均使用了棘白菌素類藥物[13]。但由于技術(shù)手段的局限性而錯誤將長孢洛德酵母菌鑒定為近平滑念珠菌時，因棘白菌素類藥物對近平滑念珠菌作用較弱，可能會造成臨床診斷及治療的延誤，從而給患者帶來經(jīng)濟負擔(dān)及增加死亡率。由于現(xiàn)有鑒定技術(shù)可能存在的不足，臨床感染長孢洛德酵母菌的檢出率被低估。因此，提高微生物實驗室對該菌的識別能力和臨床對該菌感染的重視度十分重要。