張宇藺，蘇寧，陳海鵬，秦國英，陸文香，徐衛(wèi)東，袁櫟，鐘橋(.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科, 江蘇蘇州500；.南京醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，南京66)

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)也被稱為B族鏈球菌(group B streptococcus，GBS)，不僅可導(dǎo)致新生兒侵襲性感染[1]，亦可造成免疫力低下人群的感染[2]。青霉素為抗GBS感染治療的首選藥物，但對(duì)于青霉素過敏人群，臨床常采用左氧氟沙星等氟喹諾酮類抗菌藥物替代治療。通過抑制細(xì)菌DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，左氧氟沙星可以影響細(xì)菌DNA復(fù)制、修復(fù)和重組，進(jìn)而達(dá)到抑菌效果。細(xì)菌內(nèi)DNA解旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶一旦發(fā)生突變，則可以導(dǎo)致喹諾酮類抗菌藥物耐藥[3]。鑒于此，本研究擬通過分析DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶等基因突變、血清型及多位點(diǎn)序列分型等，了解蘇州地區(qū)GBS耐左氧氟沙星的機(jī)制及菌株流行特征；通過分析耐藥菌株蛋白質(zhì)譜特征峰，探討蛋白質(zhì)譜特征峰用于左氧氟沙星耐藥菌株的快速鑒別能力。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院2018年1月至2019年1月臨床連續(xù)分離非重復(fù)GBS菌株132株，其中左氧氟沙星耐藥菌株(LRGBS)58株，敏感菌株(LSGBS)74株。菌株來源于女性生殖道113株、新生兒胃液8株、血液3株、尿液3株、痰液及口咽拭子4株以及羊水1株。所有菌株經(jīng)菌落形態(tài)、溶血特征、革蘭染色觀察后，采用BD Phoenix-100TM全自動(dòng)微生物鑒定儀以及Bruker 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)儀進(jìn)行鑒定，藥敏試驗(yàn)采用其配套藥敏系統(tǒng)檢測(cè)，左氧氟沙星藥敏結(jié)果判斷依據(jù)2018年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)微生物藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌株無乳鏈球菌ATCC 12403(血清型Ⅲ型)以及大腸埃希菌ATCC 25922均為本室保存菌株。

1.2主要儀器及試劑 Phoenix-100TM細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及配套試劑(BD公司)，MALDI-TOF MS鑒定系統(tǒng)及配套試劑(Bruker公司)，PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)以及GelDoc XR凝膠成像儀(Bio-Rad公司)，NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)(NanoDrop公司)；哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖生物公司)，基因組DNA提取試劑盒(北京全式金公司)，Taq聚合酶、dNTP試劑以及核酸marker DL2000(日本TaKaRa公司)，瓊脂糖(美國Sigma公司)，膠回收試劑盒(美國Axygen公司)，凝膠電泳指示劑GelRed(江蘇博美達(dá)公司)，引物合成及測(cè)序由蘇州金唯智公司完成。

1.3細(xì)菌基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取DNA，濃度經(jīng)NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)并以吸光度比值(A260 nm/A280 nm)在1.6～1.9之間為宜。參考文獻(xiàn)[4-5]合成DNA解旋酶(gyrA)、拓?fù)洚悩?gòu)酶(parC和parE)以及血清型cps基因引物(見表1)。依據(jù)cps基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小可以分成不同血清型，其中Ⅰa型擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為521 bp和1 826 bp，Ⅰb型擴(kuò)增產(chǎn)物約為770 bp，Ⅱ型擴(kuò)增產(chǎn)物約為397 bp，Ⅲ型擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 800 bp，Ⅳ型擴(kuò)增產(chǎn)物約為578 bp，Ⅴ型擴(kuò)增產(chǎn)物約為701 bp，Ⅵ型擴(kuò)增產(chǎn)物約為487 bp，Ⅶ型擴(kuò)增產(chǎn)物約為371 bp，Ⅷ型擴(kuò)增產(chǎn)物約為282 bp，其余為未定型。PCR體系為20 μL，包括10×PCR緩沖液2 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板 1 μL(約50 ng)，ExTaq聚合酶0.5 U，ddH2O 13.2 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物公司采用ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAstar Lasergene v7.1軟件MegAlin模塊，選擇Clustal W算法進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并顯示保守序列及保守性；Chromas軟件分析主要突變位點(diǎn)。

1.4多位點(diǎn)序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)分型 用PCR法擴(kuò)增GBS 7個(gè)管家基因(adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcX和tkt)，引物序列(見表1)、反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件均參照MLST網(wǎng)站(http://pubmlst.org/sagalactiae/)[6]。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行基因測(cè)序，將序列數(shù)據(jù)提交MLST網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，獲得管家基因組合編碼，最終確定菌株序列分型(sequence typing,ST)。

1.5LRGBS菌株質(zhì)譜特征峰鑒定及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用甲酸萃取法提取GBS菌株蛋白質(zhì)，使用Flex control軟件采集GBS菌株蛋白質(zhì)譜峰。比較LRGBS與LSGBS菌株間的蛋白質(zhì)譜差異特征峰，將132株菌隨機(jī)分成訓(xùn)練集和測(cè)試集，其中，訓(xùn)練集含有46株LRGBS和59株LSGBS，測(cè)試集含有12株LRGBS和15株LSGBS。用ClinProTools 3.0軟件讀取MALDI-TOF質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)，通過基線校正等質(zhì)譜數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)處理，計(jì)算信噪比≥5且質(zhì)荷比在2 000～10 000 m/z之間的質(zhì)譜峰峰面積及強(qiáng)度，分別計(jì)算2組間平均峰面積與峰強(qiáng)度比值(Ave)、標(biāo)準(zhǔn)差(s)以及變異系數(shù)(CV)等；正態(tài)性分布檢驗(yàn)采用Anderson-Darling擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，其P<1為非正態(tài)分布，而P>1為正態(tài)分布；2組間差異質(zhì)譜峰比較采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon檢驗(yàn)計(jì)算，以P<0.05為2組間差異峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6模型建立及外部驗(yàn)證 用ClinProTools 3.0軟件將篩選獲得的差異蛋白質(zhì)譜峰，用3種不同數(shù)據(jù)模型算法，即遺傳算法(genetic Algorithm，GA)、監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法(Supervised Neural Network，SNN)和快速分類算法(Quick Classifier，QC)，建立預(yù)測(cè)模型。用測(cè)試集27株GBS菌株質(zhì)譜圖譜對(duì)所建立的3個(gè)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，以評(píng)估所建立模型區(qū)分耐左氧氟沙星菌株的敏感性和特異性。

表1 本研究所用引物序列信息

2 結(jié)果

2.1LRGBS菌株DNA解旋酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變 58株LRGBS菌株gyrA、parC及parE基因編碼區(qū)測(cè)序結(jié)果顯示：gyrA基因在第81位氨基酸發(fā)生突變，由野生型TCA編碼絲氨酸(Ser)突變?yōu)門TA編碼亮氨酸(Leu)，記為gyrA_Ser81Leu，突變率89.7%(52/58)，其余6株為野生型；parC基因第79位氨基酸發(fā)生突變，由野生型TCC編碼絲氨酸(Ser)突變?yōu)門AC、TTC和GCC，分別編碼酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和丙氨酸(Ala)，即parC_Ser79Tyr、parC_Ser79Phe和parC_Ser79Ala，突變率分別為60.3%(35/58)、20.7%(12/58)和13.8%(8/58)，其余3株為野生株；parE基因第225位氨基酸發(fā)生突變，由野生型CAT編碼組氨酸(His)突變?yōu)門AT編碼酪氨酸(Tyr)，即parE_His225Tyr，突變率為81%(47/58)，其余11株為野生株。見圖1。基因突變模式匯總結(jié)果顯示，58株LRGBS菌株中發(fā)生gyrA_Ser81Leu+parC_Ser79Tyr+parE_His225Tyr突變26株，占44.8%；其次為gyrA_Ser81Leu+parC_Ser79Phe+parE_His225Tyr突變11株，占18.9%。見表2。

注：A，為gyrA野生型；B，為gyrA突變株，其第81位氨基酸突變?yōu)長eu，編碼基因?yàn)門TA；C，為parC野生型；D～F，為parC突變株，其第79位氨基酸分別突變?yōu)門yr、Ala以及Phe，編碼基因分別為TAC、TTC和GCC；G，為parE野生型；H，為parE突變株，其第225位氨基酸突變?yōu)門yr，編碼基因?yàn)門AT。

2.2LRGBS菌株血清型及MLST分型 58株LRGBS菌株檢出血清型Ⅲ型32株，占55.2%；Ⅰb型15株，占25.9%；Ⅰa型6株，占10.3%；Ⅴ型4株，占6.9%；Ⅵ型1株。MLST分型顯示,LRGBS分為ST19(34株，58.6%)、ST23(12株，20.7%)、ST1(5株，8.6%)、ST591型(5株，8.6%)以及ST17(2株，3.4%)。32株血清Ⅲ型菌株有29株為ST19型，占90.6%；15株血清Ⅰb型菌株有9株為ST23型，占60%。見圖2。

表2 LRGBS菌株DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變及分型特征

注：M，DL2000 DNA marker；1，陰性對(duì)照；2，陽性對(duì)照 GBS ATCC 12403(Ⅲ型)；3～12，臨床菌株，其中，3～4為Ⅰa型，5～6為Ⅰb型，7～10為Ⅲ型，11為Ⅴ型，12為Ⅵ型。

2.3LRGBS菌株質(zhì)譜特征峰鑒定及驗(yàn)證 用ClinPro Tools 3.0軟件進(jìn)行對(duì)訓(xùn)練集2組間差異質(zhì)譜峰統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，質(zhì)核比為6 894、3 445、5 076、4 544以及3 721 m/z的峰為鑒別LSGBS與LRGBS間最主要的蛋白質(zhì)譜峰，見表3。經(jīng)Anderson-Darling擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)上述幾種差異蛋白質(zhì)峰P值趨向0，提示非正態(tài)分布。用Wilcoxon檢驗(yàn)來判斷差異峰6 894、3 445、5 076、4 544以及3 721 m/z的P值均小于0.001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

用GA、SNN和QC 3種預(yù)測(cè)算法建立相應(yīng)模型，并對(duì)測(cè)試集27株GBS進(jìn)行外部驗(yàn)證計(jì)算。結(jié)果顯示，采用GA算法模型，僅有2株LRGBS被錯(cuò)誤地分類到LSGBS組，1株LSGBS被錯(cuò)誤分類到LRGBS組。GA算法對(duì)GBS判斷是否為左氧氟沙星耐藥的敏感性達(dá)到90.9%，且特異性達(dá)87.5%，陽性預(yù)測(cè)值為83.3%，陰性預(yù)測(cè)值為93.3%。而SNN算法的敏感性僅為68.8%，特異性為90.9%；QC算法敏感性為56.3%，特異性為72.7%。

表3 LRGBS和LSGBS差異質(zhì)譜峰統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

不同地區(qū)分離的GBS菌株對(duì)氟喹諾酮的耐藥性存在較大差異。歐美國家分離GBS對(duì)氟喹諾酮較為敏感[7-8]，而亞洲國家如韓國、中國等分離株對(duì)氟喹諾酮耐藥率較高，可達(dá)32.7%[9-10]。本研究表明，蘇州地區(qū)臨床分離GBS對(duì)左旋氧氟沙星耐藥率高達(dá)43.9%。值得注意的是，歐美國家GBS對(duì)氟喹諾酮的耐藥性也呈逐年遞增態(tài)勢(shì)。一項(xiàng)法國8 757株GBS菌株調(diào)查研究表明，2014年GBS對(duì)氟喹諾酮的耐藥率比2007年增加7.5倍[7]。因此，調(diào)查本地區(qū)臨床分離GBS菌株對(duì)氟喹諾酮的耐藥性，明確其分子流行病學(xué)特征，對(duì)今后制定合理抗感染策略具有重要的指導(dǎo)意義。

DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ基因突變是介導(dǎo)GBS對(duì)氟喹諾酮耐藥的主要機(jī)制[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，LRGBS菌株gyrA和parE基因突變僅存在單一突變形式，即gyrA_Ser81Leu和parE_His225Tyr，突變率分別為94.8%(55株)和81%(47株)。然而，parC基因檢出多種突變形式，但均在第79位氨基酸，即parC_Ser79Tyr、parC_Ser79Phe和parC_Ser79Ala，突變率分別為60.3%(35株)、20.7%(12株)以及13.8%(8株)。意大利一項(xiàng)研究[11]表明，僅parC_Ser79Phe突變的GBS菌株可引起低水平氟喹諾酮耐藥，其對(duì)左氧氟沙星的最低抑菌濃度(MIC)值為4 μg/mL，而同時(shí)具有g(shù)yrA_Ser81Leu和parC_Ser79Phe突變的GBS容易引起高水平耐藥，其對(duì)左氧氟沙星的MIC值大于32 μg/mL。然而，本研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在3種突變位點(diǎn)的GBS菌株占較大比例(77.6%，45株)，這提示其可能介導(dǎo)氟喹諾酮高水平耐藥。

莢膜多糖是構(gòu)成GBS不同血清型的物質(zhì)基礎(chǔ)，而血清型Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等為主要流行血清型[1,12]。本研究表明，蘇州地區(qū)LRGBS菌株多為血清型Ⅲ型(32株)，其次為Ⅰb型(15株)，分別占比55.2%和25.9%。這與Wang等[10]報(bào)道我國分離的耐氟喹諾酮GBS菌株以血清型Ⅲ型為主有所不同，提示血清學(xué)分型存在著一定的地區(qū)差異。此外，法國報(bào)道耐氟喹諾酮GBS菌株多以血清型Ⅴ型為主[7]，而阿根廷以Ⅰb型為主[13]，我國大陸及臺(tái)灣地區(qū)則多以Ⅲ型為主[10,14]，但MLST分型結(jié)果顯示，多以ST19型為主。而本研究中發(fā)現(xiàn)，血清型Ⅲ型LRGBS菌株大多為ST19型，而血清Ⅰb型菌株多為ST23型。細(xì)菌群落分析可知，ST19型屬于克隆復(fù)合體(clonal complex，CC)17型，而ST23則來源于CC23型。這提示本地區(qū)流行的LRGBS菌株主要存在2種不同克隆來源。

MALDI-TOF MS技術(shù)不僅用于菌種快速鑒定，還可就其采集的蛋白質(zhì)特征峰進(jìn)行細(xì)菌毒力、耐藥性等特性快速判斷。研究發(fā)現(xiàn)，高毒力ST17型GBS菌株在7 620 m/z處存在特征質(zhì)譜峰，可以作為快速篩查標(biāo)志[15]。而本研究發(fā)現(xiàn)，LRGBS菌株與LSGBS菌株相比，存在5種獨(dú)特表達(dá)的差異特征峰，分別為6 894、3 445、5 076、4 544以及3 721 m/z。采用外部驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，GA算法建立的預(yù)測(cè)模型可對(duì)LRGBS進(jìn)行快速鑒別，且具有較高的診斷敏感性和特異性。但仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大測(cè)試菌株數(shù)量，以全面評(píng)估本研究篩選的差異特征峰在快速鑒別LRGBS菌株中的準(zhǔn)確性。