黎昕 龍官寶 趙新陽 張俊 肖超文

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院肝膽胰外科，湖北 武漢 430014)

肝細(xì)胞癌是常見的高死亡率原發(fā)性惡性腫瘤，盡管臨床上采用了許多治療策略，但是肝癌患者的5年生存率仍然很低〔1〕。目前尚無有效的治療方法，預(yù)防和早期診斷是治療肝細(xì)胞癌的理想方法，需要尋找有效的生物標(biāo)志物用于肝癌的預(yù)后和預(yù)測。過去幾十年，非編碼RNA如microRNA、長鏈非編碼(lnc)RNA在肝癌中的作用被廣泛研究，然而環(huán)狀(circ)RNA在肝癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚不清楚。circRNA是一類新的非編碼RNA，在真核基因表達(dá)中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，其特征為3′和5′剪接位點(diǎn)之間形成共價(jià)連接，即反向剪接。circRNA現(xiàn)在被認(rèn)為是編碼序列的重要調(diào)控因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用〔2〕。以往的研究已證實(shí)環(huán)狀RNA-103809/小微RNA-620(circular RNA-103809/miRNA-620, circRNA-103809/miR-620)通路參與到肝癌細(xì)胞增殖〔3〕，然而并沒有闡述miR-620作用的下游。已有研究表明，miR-620可以調(diào)控GPC5參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展〔4〕。近年來，除了肺腺癌，GPC5還被證實(shí)參與到乳腺癌〔5〕、淋巴瘤〔6〕、胃癌〔7〕、前列腺癌〔8〕和腎病綜合征〔9〕等多種疾病之中。本研究擬分析circRNA-103809/miR-620/GPC5在肝細(xì)胞癌中的作用機(jī)制，為肝細(xì)胞癌的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1Hep-3B細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Hep-3B和正常肝細(xì)胞系LO2購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。Hep-3B細(xì)胞使用含10%胎牛血清(Cat.10082-147，Gibco)和1%青霉素/鏈霉素(Cat.No.15140-12，Invitrogen)的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)，于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。LO2使用DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)，其他條件與肝細(xì)胞癌細(xì)胞系培養(yǎng)條件相同。細(xì)胞接種于6孔板中，按照說明書步驟使用LipofectamineTM2000 (Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，circRNA-103809過表達(dá)質(zhì)粒、circRNA-103809 siRNA、miR-620 mimic、miR-620 siRNA、GPC5的siRNA對照購于GenePharma。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR 使用Trizol(Invitrogen)按照說明提取總RNA并測濃度，TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems)進(jìn)行miR620逆轉(zhuǎn)錄，第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)進(jìn)行circRNA、GPC5逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBRs GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems)在ABI7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)完成qRT-PCR擴(kuò)增，使用ΔΔCT 法進(jìn)行分析。GAPDH為circRNA、GPC5的內(nèi)參，U6為miRNA內(nèi)參。circRNA-103809正向引物：5′-AAAGAGTTTTTGGAAGACGTC-3′；反向引物：5′-TGGTGGCATGTTTTGTCATT-3′。miR-620正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGATGGAGATAGATA T-3′；反向引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATTTCTAT-3′。GPC5正向引物：5′-A GACCACCACAAGGAACAGTG-3′；反向引物：5′-AGACTGGGCTTTGA TTCCATT-3′。GAPDH正向引物：5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′；反向引物：5′-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3′。U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，反向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′。

1.3Western印跡 使用RIPA裂解液(Solarbio)提蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒(Solarbio)濃度。10%十二烷基硫酸鈉(SDS)/聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質(zhì)，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。3%BSA室溫孵育30 min，4℃一抗(anti-GPC5：ab107493，1∶500，Abcam；GAPDH：ab9485，1∶2 000，Abcam)孵育16 h，TBST洗3遍，二抗(800R/800M，1∶10 000，Odyssey)室溫孵育1 h，TBST洗3遍后，使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)檢測。

1.4細(xì)胞增殖試驗(yàn) 使用CCK-8(Dojindo)測定細(xì)胞活性。將細(xì)胞接種到96孔板(5 000/100 μl)，每孔加入10 μl CCK-8，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀(Bio-Rad)在450 nm測定吸光度。

1.5集落形成試驗(yàn) 細(xì)胞接種在6孔板(500個(gè)/孔)37℃培養(yǎng)14 d，4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)包含至少50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNQ檢驗(yàn)，采用Graphpad prism8進(jìn)行圖制作。

2 結(jié) 果

2.1Hep-3B中circRNA-103809、mi-RNA620、GPC5表達(dá)水平 對照組的LO2細(xì)胞circRNA-103809相對表達(dá)量為1.000 0±0.079 20，Hep-3B細(xì)胞中circRNA-103809低表達(dá)，其相對表達(dá)量為0.231 4±0.021 80。對照組的LO2細(xì)胞miR-620相對表達(dá)量為1.000 0±0.063 2，Hep-3B細(xì)胞中miR-620高表達(dá)，相對表達(dá)量為5.578 3±0.378 5。對照組的LO2細(xì)胞GPC5相對表達(dá)量為1.000 0±0.089 2，Hep-3B細(xì)胞中GPC5低表達(dá)，相對表達(dá)量為0.331 4±0.054 4。通過Western印跡檢測蛋白水平，Hep-3B細(xì)胞中GPC5表達(dá)量(0.533 2±0.076 2)明顯低于LO2細(xì)胞(1.000 0±0.089 2，P<0.05)，見圖1，推測在肝癌細(xì)胞中GPC5處于miR-620下游。

圖1 Western印跡檢測LO2、Hep-3B細(xì)胞系GPC5表達(dá)量

2.2Hep-3B中miR-620通過調(diào)控GPC5影響細(xì)胞增殖 為了驗(yàn)證GPC5處于miR-620下游的猜想，用miR-620的siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-3B細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后檢測GPC5蛋白水平。在Hep-3B細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-620的siRNA后GPC5的表達(dá)水平(1.778±0.096)是對照組(1.001±0.093)的1.776倍(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)miR-620的siRNA與GPC5的siRNA，GPC5的表達(dá)水平(1.446±0.097)比單轉(zhuǎn)miR-620 siRNA組下調(diào)(P<0.01)(圖2)。

圖2 各組GPC5蛋白表達(dá)

在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h檢測細(xì)胞活力，miR-620 siRNA組的細(xì)胞增殖活性相比于對照組均降低，72 h時(shí)，miR-620 siRNA組細(xì)胞活性為對照組的50.3%(P<0.01)。共轉(zhuǎn)組比單轉(zhuǎn)組細(xì)胞活性上升(P<0.01，表1)。miR-620 siRNA組的集落計(jì)數(shù)相比于對照組減少，為對照組的48.6%(P<0.01)。共轉(zhuǎn)組比單轉(zhuǎn)組集落數(shù)增加(P<0.01)見圖3。證明GPC5在肝癌細(xì)胞中受到miR-620反向調(diào)控，降低miR-620的水平可以引起GPC5水平上升，并抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

表1 Hep-3B中miR-620通過調(diào)控GPC5影響細(xì)胞增殖

圖3 各組細(xì)胞集落形成(結(jié)晶紫，×200)

2.3Hep-3B中circRNA-103809調(diào)控miR-620/GPC5影響細(xì)胞增殖 過表達(dá)circRNA-103809發(fā)現(xiàn)GPC5的表達(dá)水平(1.608±0.092)為對照組(1.003±0.082)的1.60倍(P<0.01，圖4)。同時(shí)過表達(dá)circRNA-103809和miR-620時(shí)，GPC5水平(1.203±0.086)比單過表達(dá)circRNA-103809下降(P<0.01，圖4)。用CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況，過表達(dá)circRNA-103809使細(xì)胞增殖活性降低，共同過表達(dá)時(shí)細(xì)胞增殖活性有所恢復(fù)。72 h時(shí)，過表達(dá)circRNA-103809后細(xì)胞活性為對照組49.7%(P<0.01)，而共同過表達(dá)組比單過表達(dá)組，細(xì)胞活性上升，見表2。過表達(dá)circRNA-103809組的集落計(jì)數(shù)相比于對照組減少，為對照組25.80%(P<0.01，表2)。共轉(zhuǎn)組比單轉(zhuǎn)組集落數(shù)增加(圖5)。

圖4 Hep-3B中circRNA-103809調(diào)控miR-620/GPC5表達(dá)

表2 Hep-3B中circRNA-103809調(diào)控miR-620/GPC5影響細(xì)胞增殖

圖5 Hep-3B中circRNA-103809調(diào)控miR-620/GPC5對細(xì)胞集落的影響(結(jié)晶紫，×200)

3 討 論

近年來，已有研究指出，GPC5與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。GPC5是Glypican基因家族的成員，可編碼細(xì)胞表面蛋白聚糖。迄今為止，哺乳動物中已經(jīng)鑒定出了六種Glypican家族成員(GPC1-6)，它們在調(diào)節(jié)腫瘤生長、分化和遷移等方面起著不同的作用。GPC5在淋巴瘤過表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。但是在肺腺癌、乳腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)了GPC5的水平降低，并且其下調(diào)有助于非吸煙者肺癌的發(fā)展，這表明GPC5可能是肺癌和乳腺癌的潛在抑制基因。miRNA-620可調(diào)控GPC5參與到肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中。根據(jù)我們的研究，circRNA-103809通過調(diào)控miRNA-620在肝癌細(xì)胞的增殖、遷移等過程中起作用。因此我們想探究在肝癌細(xì)胞系中GPC5是否是miR-620的下游靶基因，并通過circRNA-103809/miRNA-620/GPC5這一條通路在細(xì)胞增殖中起作用。本實(shí)驗(yàn)表明在肝癌細(xì)胞系Hep-3B中，circRNA-103809可以通過下調(diào)miRNA-620的水平，進(jìn)而提高GPC5的水平，以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。miRNA-620和GPC5都可以作為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。此外，我們也在開展動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這一條通路的體內(nèi)水平對肝癌的作用。