劉景瑞 薛彬靜 王 飛 王葉元 嚴(yán)會(huì)超

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蠶絲科學(xué)系 廣東廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藝術(shù)學(xué)院 廣東廣州 510642）

1 前言

1.1 蠶種保存現(xiàn)狀

我國(guó)作為擁有悠久歷史的蠶桑大國(guó)，家蠶種質(zhì)資源豐富，為家蠶遺傳育種和遺傳學(xué)研究提供了良好素材。為避免種質(zhì)資源消失，建立種質(zhì)資源庫(kù)顯得尤為重要，而研究家蠶種質(zhì)資源保存對(duì)蠶業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

蠶種冷藏是蠶種保護(hù)工作的重要措施，生產(chǎn)上蠶卵冷藏的方法主要有滯育卵冷藏法、不完全滯育卵冷藏法、冷藏浸酸種浸酸后的冷藏抑制處理及即時(shí)浸酸種浸酸后冷藏等。滯育卵冷藏的方法有單式冷藏和復(fù)式冷藏。廣東多采用單式冷藏，少數(shù)地區(qū)采用復(fù)式冷藏。單式冷藏適合在用種期不超過(guò)140 d 的情況下采用，復(fù)式冷藏一般在用種期不超一年的情況下采用。如遇到蠶種供應(yīng)有余，為減少損失，則采用復(fù)式冷藏。不完全滯育卵的冷藏方法如下：蠶卵產(chǎn)后在25 ℃、相對(duì)濕度75%～80%的條件下，經(jīng)過(guò)45～62 h（2～3 d），卵色處于赤豆色到深赤豆色之間，此階段的蠶種可冷藏50～70 d。蠶卵產(chǎn)后在25 ℃、相對(duì)濕度75%～80%的條件下，經(jīng)過(guò)72～120 h（3～5 d），卵色處于深赤豆色到固有色之間，此階段的蠶種可冷藏80～90 d。冷藏浸酸種浸酸后的冷藏抑制處理方法如下：浸酸后的蠶種在25 ℃條件下經(jīng)過(guò)20～24 h，胚子發(fā)育到丙1至丙2階段時(shí)，經(jīng)中間溫度13～15℃保護(hù)2 h 后移入內(nèi)庫(kù)以5 ℃冷藏，冷藏限期為30d左右[1]。

1.2 胚胎動(dòng)物的保護(hù)研究

為保持物種的多樣性，物種的生殖細(xì)胞保存這一項(xiàng)工作十分重要。低溫保存生殖細(xì)胞可以抑制細(xì)胞的發(fā)育，使用保護(hù)劑可增強(qiáng)細(xì)胞的抗凍性、保持細(xì)胞的活性，在需要用細(xì)胞時(shí)解凍便可以恢復(fù)其活性，讓其繼續(xù)發(fā)育生長(zhǎng)。文獻(xiàn)資料顯示，目前低溫保護(hù)生殖細(xì)胞的保護(hù)劑主要有甘油、二甲基亞砜、海藻糖、乙二醇。這些保護(hù)劑主要用于畜牧、水產(chǎn)、生命科學(xué)等方面研究。

畜牧方向，郝愛(ài)玲等[2]取公牛鮮精液，在4 ℃環(huán)境下加入甘油溶液保存6d，從而篩選出有利于牛鮮精4℃保存的最佳甘油濃度為4%；王世銀等[3]使用2%、4%、6%、8%四種濃度的甘油、乙二醇和DMSO 作為保護(hù)劑，將其添加至雞精液，結(jié)果顯示濃度為6%的甘油對(duì)雞精液冷凍保存的保護(hù)效果最好，且保護(hù)劑組合甘油+DMSO 組冷凍保存的效果略好于其他組。

水產(chǎn)方向，丁淑燕等[4]取興國(guó)紅鯉精子加入8% DMSO保護(hù)劑，保存于-196 ℃液氮中，在37 ℃水浴鍋里水浴100 s解凍，凍存前后的精子密度和活動(dòng)率均無(wú)明顯差異；程順等[5]在超低溫環(huán)境下冷凍保存大黃魚精子，以甘油為保護(hù)劑，結(jié)果顯示以5%～20%甘油保護(hù)劑保存大黃魚精子的效果較佳，其中甘油濃度為10%時(shí)效果最佳。

生命科學(xué)方向，邵同先等[6]取8份志愿者的精液凍存（-196℃）10d，加入復(fù)方甘油保護(hù)劑，精液解凍激活后鏡檢，精子活力接近鮮精的水平；齊映亮等[7]選取健康羊膜分為4 組，A 組為空白對(duì)照組，B 組為DMEM/甘油/ DMSO/海藻糖組，C 組為DMEM/甘油/DMSO 組，D 組為DMEM/甘油組，冷凍保存后與新鮮羊膜比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)論為DMEM、甘油、DMSO、海藻糖可作為新型保護(hù)劑用于精液深低溫高活性保存。

從以上實(shí)驗(yàn)可以看出，甘油和DMSO 都具有抗凍能力，且增強(qiáng)了動(dòng)物鮮精和健康羊膜的抗凍性；甘油和DMSO 能在-196 ℃的超低溫條件下保護(hù)生殖細(xì)胞；甘油和DMSO 混合使用也具有抗凍性；冷藏后的鮮精需水浴解凍。實(shí)驗(yàn)證明，甘油和DMSO 對(duì)血細(xì)胞、動(dòng)物鮮精低溫保存有一定的作用。之所以選取甘油或DMSO 作為保護(hù)液，是因?yàn)楦视褪亲钤?、最傳統(tǒng)的防凍液，主要運(yùn)用于植物、動(dòng)物胚胎、昆蟲的低溫防凍，或制造業(yè)的除凍劑。10%的甘油水溶液冰點(diǎn)為-1.6 ℃，30%的甘油水溶液冰點(diǎn)為-9.5 ℃。DMSO 是一種含硫有機(jī)化合物，能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn)，抑制細(xì)胞程序性死亡[8]。純DMSO 的冰點(diǎn)是18.45 ℃，含水40%的DMSO 在- 60 ℃不凍，且DMSO 遇水、雪混合時(shí)會(huì)放熱。因此DMSO 可作涂料等的保護(hù)劑，汽油、航煤的防冰劑，以及骨髓、血液、細(xì)胞低溫保存的保護(hù)劑等[9]。

1.3 研究目的及意義

蠶農(nóng)根據(jù)歷年的養(yǎng)蠶數(shù)量、市場(chǎng)的需求制訂下一年的用種計(jì)劃，為適應(yīng)用種計(jì)劃，20世紀(jì)80年代開始了蠶種冷藏浸酸技術(shù)研究。蠶種冷藏的主要作用是解除蠶卵滯育和抑制蠶卵的發(fā)育，以便結(jié)合養(yǎng)蠶計(jì)劃適時(shí)出庫(kù)催青，確保蠶種的孵化率及蠶發(fā)育的質(zhì)量，待保護(hù)一定的時(shí)間后，通過(guò)浸酸的方法來(lái)解除滯育。然而生產(chǎn)過(guò)程中蠶種發(fā)放的規(guī)律性極差，常會(huì)遇到蠶種冷藏超過(guò)期限或者提前出庫(kù)的問(wèn)題，這樣會(huì)導(dǎo)致其成為超期蠶種或者在浸酸時(shí)造成蠶卵的浪費(fèi)，不利于蠶種的供應(yīng)。因此，生產(chǎn)上需要更靈活的技術(shù)方法去適應(yīng)長(zhǎng)期大量養(yǎng)蠶的蠶種需求，冷藏浸酸技術(shù)需要更多樣性才能適應(yīng)生產(chǎn)的需求。

經(jīng)文獻(xiàn)查閱，目前僅有關(guān)于甘油或DMSO 對(duì)動(dòng)物生殖細(xì)胞的保存研究，未見對(duì)蠶卵的保存等相關(guān)研究文獻(xiàn)。Jun Kusu 等[10]將家蠶五齡幼蟲卵巢器官芽取出，用不同濃度的甘油處理，在液氮中保存。將解凍后的卵巢移植到五齡雌幼蟲體內(nèi)，根據(jù)寄主發(fā)育情況，五齡雌幼蟲的卵巢中有20%以上發(fā)育成帶卵殼的成熟卵。通過(guò)孤雌生殖激活，成熟卵開始胚胎發(fā)育，孵化出幼蟲。孵化出的幼蟲和正常的幼蟲一樣完成了胚胎后發(fā)育。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，甘油對(duì)家蠶低溫保存有一定的作用。為進(jìn)一步探索甘油、DMSO 對(duì)蠶卵保存的效果，初步篩選出甘油和DMSO 保存蠶卵的條件，期望找出延長(zhǎng)保存蠶卵的材料及方法，為蠶種冷藏保護(hù)研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

1.蠶卵品種

大造蠶卵，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶絲科學(xué)系提供。

2.試劑

甘油（由廣州化學(xué)試劑生產(chǎn)）、DMSO（由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）、純凈水。

3.設(shè)備

LRH-250 -HS 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、松下NR-C320 WP- S三門變頻風(fēng)冷無(wú)霜節(jié)能多門大冰箱。

2.2 方法

1.試驗(yàn)處理

家蠶在常規(guī)條件下飼養(yǎng)和保護(hù)，取其母蛾產(chǎn)的蠶卵，分三種處理。

（1）即時(shí)浸酸卵。將母蛾產(chǎn)下的卵置于25 ℃、相對(duì)濕度75%～85%的環(huán)境保護(hù)約20 h 后，取蠶卵樣品進(jìn)行即時(shí)浸酸，鹽酸比重為1.075，液溫為46 ℃，浸酸4.5 min；用流動(dòng)水沖洗脫酸約30 min，晾干；將蠶卵隨機(jī)分為8 份，每份設(shè)3 個(gè)重復(fù)；在管內(nèi)分別加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15% DMSO，或不添加任何東西（作為空白對(duì)照組）；將放有蠶卵的管分別在4 ℃、0 ℃的條件下保存；定期（每隔10 d）將蠶種樣品取出。

（2）赤豆色卵。將蠶卵置于25 ℃、相對(duì)濕度75%～85%的環(huán)境保護(hù)，蠶卵發(fā)育至赤豆色時(shí)，取蠶卵樣品，將蠶卵隨機(jī)分為8 份，每份設(shè)3 個(gè)重復(fù)；在管內(nèi)分別加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15% DMSO，或不添加任何東西（作為空白對(duì)照組）；將放有蠶卵的管分別在4 ℃、0 ℃的條件下保存；從第40 d 開始，定期（每隔10 d）將蠶種樣品取出。

（3）深赤豆色卵。將蠶卵置于25 ℃、相對(duì)濕度75%～85%的環(huán)境保護(hù)，當(dāng)其發(fā)育至深赤豆色時(shí)，取蠶卵樣品，隨機(jī)分為8 份，每份設(shè)3 個(gè)重復(fù)；在管內(nèi)分別加入水、5%甘油、10%甘油、15%甘油、5% DMSO、10% DMSO、15%DMSO，或不添加任何東西（作為空白對(duì)照組）；將放有蠶卵的管分別在4 ℃、0 ℃的條件下保存；從第80 d 開始，定期（每隔10 d）定期將蠶種取出。

2.冷藏后的處理

取出蠶卵，用恒溫水浴鍋在37 ℃下解凍10 s，分別洗凈甘油和DMSO，晾干。即時(shí)浸酸卵晾干，放入25～26 ℃、相對(duì)濕度75%～80%的恒溫恒濕人工氣候箱中催青至孵化；而赤豆色卵和深赤豆色卵采用冷藏浸酸法進(jìn)行浸酸，鹽酸比重為1.092，液溫為47.8 ℃，浸酸5 min。取出蠶卵在流動(dòng)水中沖洗約30 min，晾干，放在25～26 ℃、相對(duì)濕度75%～80%的恒溫恒濕人工氣候箱中催青至孵化。

3.計(jì)算孵化率

計(jì)算實(shí)用孵化率。

2.3 數(shù)據(jù)分析

本研究采用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行多因素方差分析，使用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（DMRT 法）進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果

3.1 即時(shí)浸酸卵用不同保護(hù)劑保存的效果

即時(shí)浸酸卵用不同濃度的保護(hù)劑保存，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1?？傮w上看，4 ℃下冷藏的蠶卵效果較0 ℃的好；加了保護(hù)劑的蠶卵孵化率高于空白對(duì)照組，隨著冷藏時(shí)間的增加，孵化率逐漸降低；4 ℃和0 ℃下冷藏10 d 的效果最佳，孵化率均在93%以上，特別是溫度在4℃時(shí)，孵化率為100%。4 ℃冷藏30 d，5%甘油、10%甘油、5%DMSO 及10%DMSO的孵化率都在80%以上，比空白對(duì)照組分別提高了52.63%、52.63%、40.35%、45.61%。4℃下，5% DMSO保護(hù)劑的冷藏效果是最好的，主要體現(xiàn)在冷藏20 d、30 d、40 d、50 d 的孵化率比空白對(duì)照組分別提高了12.05%、40.35%、334.78%、142.86%；0℃下，5% DMSO、10%DMSO 保護(hù)劑的冷藏效果最好，對(duì)于5% DMSO 來(lái)說(shuō)，冷藏20 d、30d、40 d 的孵化率比空白對(duì)照組分別約提高了4.30%、33.33%、100%，對(duì)于10% DMSO來(lái)說(shuō)，冷藏30 d、40 d 的孵化率比空白對(duì)照組分別約提高了 16.67%、76.67%。特別是4 ℃下，加水冷藏10～80 d 的蠶卵一直都有孵化，只是孵化率低，孵化率最高出現(xiàn)在冷藏10 d，為100%；孵化率最低出現(xiàn)在冷藏70～80 d。

3.2 赤豆色卵用不同保護(hù)劑保存的效果

赤豆色卵用不同濃度的保護(hù)劑保存，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。總體上看，加保護(hù)劑的蠶卵孵化率均達(dá)不到實(shí)用孵化率要求。4 ℃冷藏的蠶卵孵化率較0 ℃的高，但隨著冷藏時(shí)間的增加，孵化率逐漸降低，冷藏50 d 的效果最佳；對(duì)于4 ℃來(lái)說(shuō)，空白對(duì)照組的孵化率高于加了保護(hù)劑和水的，所以保護(hù)劑在4℃的冷藏中效果不佳，其中水和DMSO 的效果較其他保護(hù)劑好，冷藏40 d 以5% DMSO 較好、冷藏50 d 以10%DMSO 較好，但變化規(guī)律不顯著；對(duì)于0 ℃來(lái)說(shuō)，冷藏50 d 的效果最佳，且用5%甘油保存孵化率達(dá)到83%，其中40～60 d，加了5%甘油保護(hù)劑的蠶卵保存效果最佳，而70～80 d，空白對(duì)照組和加水保存的孵化率逐漸增加明顯，空白對(duì)照組的孵化率從10%增加到73%，加水保存的蠶卵孵化率從7%增加到50%。

3.3 深赤豆色卵用不同保護(hù)劑保存的效果

深赤豆色卵用不同濃度的保護(hù)劑保存，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3?？傮w上看，0 ℃下冷藏的蠶卵孵化率較4 ℃的高，孵化率最高出現(xiàn)在冷藏80 d。4 ℃下，加DMSO 保存的蠶卵孵化率均為100%，加水、15%甘油保存的蠶卵孵化率為93%；0℃下，加水、5%甘油、10%甘油、10% DMSO、15% DMSO 保存的蠶卵孵化率均為100%，加5% DMSO 保存的蠶卵孵化率為93%。對(duì)4℃來(lái)說(shuō)，10% DMSO 的保護(hù)效果最好，冷藏120 d 前孵化率逐漸降低，120 d 后加了保護(hù)劑的蠶卵孵化率有上升趨勢(shì)。對(duì)于0℃來(lái)說(shuō)，加了水保存的蠶卵效果最佳，特別在第200 d，孵化率高達(dá)97%，其次是10% DMSO；孵化率較低的情況大部分出現(xiàn)在120～160 d內(nèi)，其中孵化率最低的是用5% DMSO 保存的蠶卵，孵化率僅為7%。

表1 即時(shí)浸酸卵用不同保護(hù)劑保存的孵化率調(diào)查

表2 赤豆色卵用不同保護(hù)劑保存的孵化率調(diào)查

續(xù)表2赤豆色卵用不同保護(hù)劑保存的孵化率調(diào)查

表3 深赤豆色卵冷藏用不同保護(hù)劑保存的孵化率調(diào)查

4 討論

4.1 不同試劑保護(hù)

對(duì)于不同方法處理的蠶卵、不同時(shí)期的蠶卵，分析數(shù)據(jù)可得DMSO 保護(hù)劑的冷藏效果更佳、水次之。即時(shí)浸酸卵，4 ℃下，5% DMSO 保護(hù)劑冷藏效果最佳，0 ℃下，10%DMSO 保護(hù)劑冷藏效果最佳；赤豆色卵，4 ℃下，水和5%DMSO 保護(hù)劑冷藏效果較佳，0 ℃下，5%甘油保護(hù)劑冷藏效果最佳；深赤豆色卵，4 ℃下，5% DMSO 保護(hù)劑冷藏效果最佳，0 ℃下，水和10% DMSO 保護(hù)劑冷藏效果最佳。

4.2 不同溫度保護(hù)

對(duì)于即時(shí)浸酸卵和赤豆色卵來(lái)說(shuō)，4 ℃保護(hù)效果最佳；對(duì)于深赤豆色卵來(lái)說(shuō)，0 ℃保護(hù)效果最佳。溫度對(duì)不同發(fā)育時(shí)期胚胎的保存效果存在差別，這可能與胚子耐低溫能力有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

4.3 不同發(fā)育期胚胎

滯育蠶卵比解除滯育的蠶卵孵化率不論是在4 ℃下還是0 ℃下都更高，發(fā)育都更整齊，由此可見，滯育蠶卵抗凍效果更好；隨著冷藏時(shí)間的增長(zhǎng)，深赤豆色卵的孵化率呈上升趨勢(shì)，可見深赤豆色卵的耐冷藏能力較赤豆色卵的好，猜測(cè)固有色的耐冷藏能力可能會(huì)更佳；從表3可以看出，0 ℃下冷藏214 d，10% DMSO 的保護(hù)效果比空白對(duì)照組好，可以推斷，固有色的蠶卵用保護(hù)劑效果可能會(huì)更好。對(duì)于即時(shí)浸酸卵，冷藏天數(shù)越多，加了保護(hù)劑保存的蠶卵孵化率越高于或持平于空白對(duì)照組，由此可以初步分析出，DMSO 或甘油對(duì)解除滯育的蠶卵有一定的保護(hù)作用。而對(duì)赤豆色卵用DMSO或甘油保存并沒(méi)有這樣的效果。深赤豆色卵隨著冷藏天數(shù)的增加孵化率提高，可能原因是隨著時(shí)間的增加，蠶卵自身解除滯育。聯(lián)系表1可以看出，保護(hù)劑對(duì)解除滯育的蠶卵是有一定的保護(hù)作用的。

4.4 試驗(yàn)中可能存在問(wèn)題

對(duì)于赤豆色的蠶卵，4 ℃條件下、冷藏60 d 的這一批蠶卵的孵化率為0，初步判定為操作不當(dāng)導(dǎo)致的，因?yàn)樵诶洳?0 d 時(shí)，用水、甘油和DMSO 保存的蠶卵依然有孵化。本實(shí)驗(yàn)只是初步研究，在無(wú)前人試驗(yàn)參考基礎(chǔ)上摸索，還有很多工作有待通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)研究與完善。

4.5 展望

在0 ℃條件下、冷藏200 d 的蠶卵，空白對(duì)照組和加水保存的孵化率都高于95%，加水的保存可以做進(jìn)一步研究；到冷藏214 d 時(shí)，加了水的蠶卵孵化率達(dá)90%，明顯高于其他試劑及空白對(duì)照組。加水保存蠶卵的冷藏效果可做進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

對(duì)于用甘油和DMSO處理的蠶卵，赤豆色蠶卵使用冷藏的效果不明顯，而深赤豆色蠶卵隨著冷藏天數(shù)的增加，使用保護(hù)劑有一定效果，但孵化率沒(méi)有達(dá)到生產(chǎn)上實(shí)用孵化率90%以上要求，但對(duì)種質(zhì)資源的保護(hù)保存仍具有一定科學(xué)意義。而對(duì)于已經(jīng)解除滯育的蠶卵來(lái)說(shuō)，保護(hù)劑具有一定的作用，特別是DMSO，增強(qiáng)了蠶卵的抗凍性? 加水保存的蠶卵是否增強(qiáng)了抗凍能力尚待進(jìn)一步研究?