張 豪 梁 爽 馮曉霞

(1廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，廣西南寧 530007； 2廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530007)

樗蠶(Philosamiacynthiacynthia)是鱗翅目(Lepidoptera)大蠶蛾科(Saturniidae)樗蠶屬(Philosamia)的吐絲營(yíng)繭昆蟲[1]，其繭可繅絲、蛹可食用的特性決定了其同時(shí)也是一種十分重要的野蠶種質(zhì)資源。催青是將解除滯育后的蠶卵在人工干預(yù)下置于適宜的溫度、濕度、空氣和光照條件中，促使卵內(nèi)胚胎正常發(fā)育至孵化出蟻蠶的技術(shù)過程[2]。催青過程中的溫濕度控制是蠶種催青的核心，需要貫穿整個(gè)催青過程，環(huán)境中適宜的溫濕度可為蠶卵胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育提供基本條件[3]。家蠶卵胚胎發(fā)育速度與催青有效積溫存在高度正相關(guān)關(guān)系[4]，蠶卵催青溫度直接影響蠶卵的孵化整齊度、孵化率高低、蟻體健康[5-9]。

孵化酶是卵生動(dòng)物(昆蟲、魚類、鳥類和爬行動(dòng)物等)胚胎發(fā)育到特定階段出現(xiàn)的一類蛋白酶，其表達(dá)受到極其精準(zhǔn)的信號(hào)調(diào)控并具有組織特異性[10]。2018年，廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院野蠶研究室成功克隆到了樗蠶孵化酶基因PccHE，并對(duì)其做了表達(dá)特性分析[11]，為后續(xù)研究樗蠶卵孵化的分子調(diào)控機(jī)制打下了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步了解樗蠶卵孵化速度與催青溫度之間的關(guān)系，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)PccHE在催青不同時(shí)期熱處理后的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了分析，現(xiàn)將有關(guān)情況報(bào)告如下，供同仁參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試樗蠶卵 樗蠶卵，由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院野蠶研究室保存提供。

1.1.2 主要試劑 TRIzon Reagent RNA提取試劑盒，購(gòu)自康為公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自Tiangen公司；熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒SsoFast，購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.1.3 主要儀器 CFX96熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；HWS-450F恒溫培養(yǎng)箱，丙林公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樗蠶卵在室內(nèi)與培養(yǎng)箱中催青的孵化率統(tǒng)計(jì) 按照浦月霞等[11]的方法在溫度25 ℃、相對(duì)濕度75%的室內(nèi)和培養(yǎng)箱中分別對(duì)樗蠶卵進(jìn)行催青，并在第10天統(tǒng)計(jì)其孵化率。試驗(yàn)區(qū)(培養(yǎng)箱)和對(duì)照區(qū)(室內(nèi))各設(shè)置8個(gè)重復(fù)區(qū)，每區(qū)約200粒蠶卵，分別挑選其中生長(zhǎng)發(fā)育情況基本一致的5個(gè)區(qū)進(jìn)行混合取樣和統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 熱處理 在溫度25 ℃、相對(duì)濕度75%的培養(yǎng)箱中對(duì)樗蠶卵進(jìn)行催青，設(shè)置進(jìn)行干熱空氣處理的試驗(yàn)區(qū)和不進(jìn)行干熱空氣處理的對(duì)照區(qū)，各8個(gè)重復(fù)區(qū)，每區(qū)約800粒蠶卵。分別在催青第2天、第5天、第8天的上午8：00隨機(jī)從8個(gè)重復(fù)區(qū)中混合選取狀態(tài)基本一致的蠶卵400粒，用46 ℃干熱空氣處理1 h，以不進(jìn)行干熱空氣處理作為對(duì)照，重復(fù)3次，于干熱空氣處理后0 h、3 h和6 h(當(dāng)日9：00、12：00和15：00)分別收集試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)的樗蠶卵樣品各20粒，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。未取樣蠶卵用于之后的孵化率統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 樗蠶卵樣品總RNA的提取及cDNA的合成 (1)總RNA的提取。按照TRIzon Reagent RNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行，分別提取培養(yǎng)箱催青過程中第2天、第5天、第8天上午9：00、12：00及15：00試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)樗蠶卵樣品的總RNA，最后將吸附柱置于一個(gè)新的RNase-Free離心管中，向吸附柱的中間部位加入30～50 μL RNase-Free水，室溫放置1 min，12 000 r/min離心1 min，收集RNA溶液，-80 ℃保存。(2)cDNA的合成。根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，反轉(zhuǎn)錄體系10 μL，5×gDNA Buffer 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free水補(bǔ)足體系至10 μL，放置于42 ℃ PCR儀器內(nèi)5 min后取出，然后加入配制好的反轉(zhuǎn)錄混合液(反轉(zhuǎn)錄試劑盒自帶)10 μL，將加入反轉(zhuǎn)錄混合液的離心管置于PCR儀中反應(yīng)，42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，最后獲得的cDNA于-20 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄混合液10 μL，反應(yīng)體系為10×Fast Buffer 2 μL，RT Enzyme 1 μL，Primer Mix 2 μL，RNase-Free水5 μL。

1.2.4 催青不同時(shí)期熱處理后不同時(shí)間樗蠶卵PccHE相對(duì)表達(dá)量的qRT-PCR定量檢測(cè) 將合成的cDNA分別用雙蒸水稀釋20倍，然后按照熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明配制10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，qRT-PCR引物名稱及序列見表1。2×SsoFast Buffer 5.00 μL，正反引物各0.25 μL，cDNA模板2.00 μL，雙蒸水2.50 μL，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，置于qRT-PCR儀器內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。設(shè)定反應(yīng)時(shí)間及參數(shù)如下：①95 ℃ 1 min；②95 ℃ 5 s；③58 ℃ 10 s；④重復(fù)②和③40個(gè)循環(huán)；⑤16 ℃恒溫。得出的△Ct按標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行計(jì)算[10，12-13]。

表1 qRT-PCR引物名稱及序列

引物名稱引物序列(5′-3′)qRT-PccHE-FGCCACGCCTGCCATCGTCAGqRT-PccHE-RCTTCCCGCTATTCTCCTCGGqRT-PccGAPDH-FGCTGGTGCTGAATATGTTGTqRT-PccGAPDH-RGCACCACGGCCATCACGCCA

1.2.5 催青不同時(shí)期熱處理后的樗蠶卵孵化率的調(diào)查試驗(yàn) 按照浦月霞等[11]的方法分別對(duì)在培養(yǎng)箱中催青第2天、第5天、第8天經(jīng)過熱處理1 h的樗蠶卵進(jìn)行孵化率統(tǒng)計(jì)，以在培養(yǎng)箱中催青第10天的樗蠶卵為對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

利用Excel 2016和GraphPad軟件對(duì)樗蠶卵孵化率和熱處理樗蠶卵后孵化酶基因PccHE的相對(duì)表達(dá)量變化數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并進(jìn)行繪圖。圖中計(jì)量數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，方差分析為單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)催青與培養(yǎng)箱中催青的樗蠶卵孵化率

從室內(nèi)與培養(yǎng)箱中催青的樗蠶卵孵化率(圖1)可以看出，催青室內(nèi)樗蠶卵的孵化率為87%，培養(yǎng)箱中樗蠶卵的孵化率為88%，室內(nèi)催青與培養(yǎng)箱中催青的樗蠶卵孵化率無(wú)顯著性差異。

圖1 室內(nèi)與培養(yǎng)箱中催青的樗蠶卵孵化率

2.2 催青不同時(shí)期熱處理后不同時(shí)間樗蠶卵PccHE的相對(duì)表達(dá)量

在胚胎發(fā)育不同時(shí)期，溫度刺激(46 ℃干熱空氣處理)后不同時(shí)間對(duì)樗蠶卵中孵化酶基因PccHE的相對(duì)表達(dá)量的影響如圖2所示：在胚胎發(fā)育早期(催青第2天)，PccHE對(duì)溫度刺激沒有響應(yīng)，熱處理后3 h和6 h的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著性差異；在胚胎發(fā)育中期(催青第5天)，PccHE對(duì)溫度刺激出現(xiàn)響應(yīng)，但在熱處理后3 h的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異，熱處理后6 h，相對(duì)表達(dá)量下降，表達(dá)量受到了抑制；在胚胎發(fā)育后期(催青第8天)，熱處理后3 h樗蠶卵中PccHE的相對(duì)表達(dá)量受到抑制，之后迅速上升。對(duì)照區(qū)同一天內(nèi)，PccHE相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著性差異。

*表示兩者間差異顯著(P<0.05)。圖2 催青不同時(shí)期熱處理后不同時(shí)間PccHE的相對(duì)表達(dá)量

2.3 催青不同時(shí)期熱處理后的樗蠶卵孵化率

從催青不同時(shí)期熱處理后不同時(shí)間PccHE的相對(duì)表達(dá)量(圖2)和催青不同時(shí)期熱處理后的樗蠶卵孵化率(圖3)可以看出，不論是在催青第5天和第8天對(duì)樗蠶卵進(jìn)行熱處理1 h，均會(huì)瞬時(shí)改變樗蠶卵中孵化酶基因PccHE的表達(dá)量(圖2)，但是對(duì)最終樗蠶卵的孵化率并沒有明顯影響，催青各時(shí)期熱處理試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)樗蠶卵的孵化率間無(wú)顯著性差異(圖3)。

圖3 催青不同時(shí)期熱處理后的樗蠶卵孵化率

3 討論

在之前的研究中，浦月霞等[11]成功從樗蠶卵中克隆到孵化酶基因PccHE全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)PccHE的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。分析發(fā)現(xiàn)PccHE的表達(dá)量在孵化時(shí)急劇升高的特性，表明該基因參與了樗蠶卵孵化的調(diào)控過程。本次試驗(yàn)，我們對(duì)胚胎發(fā)育不同時(shí)期的樗蠶卵進(jìn)行熱處理，在胚胎發(fā)育的早期(催青第2天)，該基因?qū)岽碳]有響應(yīng)(6 h內(nèi))，而在中期(催青第5天)與后期(催青第8天)均出現(xiàn)響應(yīng)，在后期熱處理后6 h內(nèi)表達(dá)水平顯著升高，表明PccHE的表達(dá)受到了熱刺激的誘導(dǎo)，推測(cè)與其特異性表達(dá)特征有關(guān)，但經(jīng)過熱處理的蠶卵和對(duì)照區(qū)蠶卵在孵化率上并無(wú)顯著性差異，推測(cè)熱處理1 h并不會(huì)影響蠶卵整體的發(fā)育。