徐 杰 謝余濤 張三妹 樓 霞 朱春群 陳 濤 張美蓉 侯啟瑞

(1浙江省蠶種質(zhì)量檢疫檢驗站，浙江杭州 310020； 2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(鎮(zhèn)江)，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

為驗證實驗室的檢驗?zāi)芰?，確保檢驗工作的公正性、科學(xué)性、準(zhǔn)確性和權(quán)威性，加強實驗室間的信息交流與成果共享，提高蠶種質(zhì)量的檢驗水平，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(鎮(zhèn)江)于2018年底組織開展了全國蠶種質(zhì)量實驗室檢測能力比對試驗，全國蠶桑主產(chǎn)省的13家省部級蠶種質(zhì)量檢驗檢測實驗室參加了比對試驗。檢測結(jié)果的有效性是檢測實驗室關(guān)注的重點，選用與實驗室工作類型和工作量相適應(yīng)的方法，有計劃地實施質(zhì)量控制是保障檢測結(jié)果有效性的重要手段；質(zhì)量控制是質(zhì)量管理的一部分，實驗室通過有計劃和有系統(tǒng)的活動，向內(nèi)部(管理層)和外部(客戶、認證認可機構(gòu))提供信任，表明實驗室能夠滿足質(zhì)量要求；“參加能力驗證或機構(gòu)之間比對、機構(gòu)內(nèi)部比對”是標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的實驗室應(yīng)實施的質(zhì)量控制方法[1]。

實驗室間比對是在預(yù)定的條件，由2個或2個以上實驗室就同一或相似的檢測對象進行檢測或測量的組織、實施和評價[2]。通過實驗室間比對可以確定實驗室的能力、識別實驗室存在的問題與實驗室間的差異，是判斷和控制實驗室能力的有效手段之一。本文結(jié)合工作實際，闡述了蠶種質(zhì)量檢測實驗室間比對試驗的組織實施和結(jié)果分析評價方法，以期提高參加比對實驗室的蠶種質(zhì)量檢測能力，達到行業(yè)質(zhì)量控制的目的。

1 實驗室間比對試驗的組織實施

組織實驗室間比對試驗，應(yīng)制定比對試驗計劃，參加比對試驗的實驗室應(yīng)嚴(yán)格按計劃實施。比對試驗計劃至少包括以下內(nèi)容。

1.1 參加實驗室

選擇參加比對的實驗室需考慮2點：一是比對實驗室的設(shè)施設(shè)備和人員能力應(yīng)大致相當(dāng)，有可比性；二是根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計方法確定參加實驗室的數(shù)量。

1.2 比對項目

蠶種檢測有母蛾微粒子病檢疫和成品卵質(zhì)量檢驗2大類，項目包括良卵粒數(shù)、良卵率、孵化率、雜交率(純度)、病卵率、病蛾率等。

1.3 樣品制備

成品卵樣品采用標(biāo)準(zhǔn)方法[3]制備。母蛾樣品采用自制方法制備，確保檢測結(jié)果的一致性。

1.4 均勻性和穩(wěn)定性檢驗

采用成品卵樣品時，一般應(yīng)進行均勻性檢測。另外，如果運輸和時間對檢測的特性量(良卵粒數(shù)、良卵率、孵化率等)可能產(chǎn)生影響時，還需要進行穩(wěn)定性檢驗。

1.4.1 均勻性檢驗 從樣品總體中隨機抽取10個樣品，按單因子方差分析(F檢驗)方法對特性量進行均勻性檢驗[4]，每個樣品重復(fù)測定2次，使用Microsoft Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。當(dāng)統(tǒng)計量F值<臨界值Fcrit時，認為樣品是均勻的。當(dāng)檢測樣品有多個待測特性量時，可從中選擇有代表性和對不均勻性敏感的特性量進行均勻性檢驗。一般可選擇良卵率項目，如果時間允許，應(yīng)選擇孵化率項目。均勻性檢驗結(jié)果分析案例如下：打開Microsoft Office Excel 2007，按表1格式輸入數(shù)據(jù)。第1步在“工具

表1 家蠶成品卵2次良卵率檢驗結(jié)果%

欄”上點擊“數(shù)據(jù)”按鈕；第2步，點擊右側(cè)“數(shù)據(jù)分析”按鈕，選擇“方差分析：單因素方差分析”，點擊“確定”；第3步，在“輸入?yún)^(qū)域”選擇表1中第2、3列數(shù)字區(qū)域，“分組方式”選擇“行”(分組方式取決于表1數(shù)據(jù)的排列方式，如橫排，則選擇“列”)，“輸出區(qū)域”選擇表1區(qū)域以外空白單元格。完成上述設(shè)置后，點擊“確定”，可在選定區(qū)域內(nèi)輸出分析結(jié)果。結(jié)果包括2張表，其中一張是各組情況概述表(表2)，內(nèi)容包括各組的總和、平均數(shù)、方差和樣本含量，另一張為方差分析表(表3)。

表2 家蠶成品卵良卵率均勻性檢驗情況%

表3 家蠶成品卵良卵率均勻性檢驗方差分析

差異來源離均差平方和(SS)自由度(df)均方(MS)統(tǒng)計量F值概率值P-value臨界值F crit組間0.05890.0060.4390.8843.020組內(nèi)0.148100.015總計0.20619

表中統(tǒng)計量F值(0.439)<臨界值Fcrit(3.020)，表明樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。如果均勻性檢驗顯示樣品是不均勻的，則需要重新選擇比對樣品。

1.4.2 穩(wěn)定性檢驗 從樣品總體中隨機抽取20個樣品，分成2組，分別置于11 ℃(中間感溫溫度)和25 ℃(運輸途中可能接觸的最高氣溫)環(huán)境下放置5 d(運輸最長送達時間)后，按t檢驗法對特性量進行穩(wěn)定性檢驗[4]，檢測方法、人員、儀器與均勻性檢驗相同。使用Microsoft Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。當(dāng)tStat值

表4 不同溫度下家蠶成品卵良卵率%

表5 不同溫度下家蠶成品卵良卵率穩(wěn)定性t-檢驗分析

t-檢驗項目11 ℃良卵率25 ℃良卵率平均99.6199.61方差0.0020.002觀測值1010合并方差0.002假設(shè)平均差0自由度(df)18t Stat值6.77E-13P(T≤t) 雙尾1t 雙尾臨界值2.101

11 ℃為中間感溫溫度，25 ℃為運輸途中可能接觸的最高溫度。表5中tStat值(6.77E-13)

1.5 樣品的保存和發(fā)放

樣品保存和發(fā)放的環(huán)境、時限應(yīng)根據(jù)比對項目做出相應(yīng)的規(guī)定。

1.6 檢測方法和數(shù)據(jù)處理

可選擇標(biāo)準(zhǔn)方法、非標(biāo)準(zhǔn)方法或自制方法，無論何種方法，都應(yīng)該制定詳細的作業(yè)指導(dǎo)書，確保檢測在相同的環(huán)境條件、規(guī)定的操作流程、相當(dāng)?shù)膬x器設(shè)備下進行。

比對計劃應(yīng)明確規(guī)定各參加實驗室在上報每個檢測數(shù)據(jù)及計算平均值時的有效位數(shù)和修約標(biāo)準(zhǔn)，確保所采集的數(shù)據(jù)正確和合理，保證統(tǒng)計結(jié)果可靠。

由于現(xiàn)行蠶種檢驗標(biāo)準(zhǔn)中對檢測結(jié)果沒有要求提供測量不確定度，比對組織者可根據(jù)需要確定參加者是否提供結(jié)果的測量不確定度。

1.7 統(tǒng)計處理和評價

檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)的特性(定量或定性)、被測量所要求的準(zhǔn)確度、最少參加實驗室數(shù)量、樣品數(shù)量、檢測重復(fù)次數(shù)等因素來選擇。統(tǒng)計方法包括差值D(實驗室偏倚的估計值)、百分相對差D(%)、Z比分數(shù)、En值等。根據(jù)不同統(tǒng)計方法制定相應(yīng)的評價準(zhǔn)則。

2 結(jié)果分析評價

2.1 定性方法

定性方法是為評價實驗室表征特定實物的能力而設(shè)計的(例如識別微粒子孢子)。定性方法可能包含比對計劃組織者專門制備外加目標(biāo)組分的檢測物品(例如在母蛾樣品中添加微粒子孢子)。因此，在性質(zhì)上這種計劃是“定性”的，它只需要依據(jù)是否檢測到“目標(biāo)組分(微粒子孢子)”來評價實驗室的能力。對于定性結(jié)果，通常無需計算。

2.2 定量方法

2.2.1t檢驗法 參加實驗室數(shù)量是2個時，可采用t檢驗法進行結(jié)果評價(參照1.4.2穩(wěn)定性檢驗)，當(dāng)tStat值

Z比分數(shù)法可采用傳統(tǒng)統(tǒng)計方法或四分位數(shù)穩(wěn)健統(tǒng)計方法進行結(jié)果分析評價，方法選擇應(yīng)考慮比對需求和參加實驗室數(shù)量等因素。四分位數(shù)穩(wěn)健統(tǒng)計方法在異常值檢出的靈敏度上高于傳統(tǒng)統(tǒng)計方法[5]，參加實驗室的數(shù)量需大于9個。

(1)傳統(tǒng)統(tǒng)計法。應(yīng)用傳統(tǒng)統(tǒng)計法，通常需要剔除離群值(異常值)，可采用萊茵達準(zhǔn)則、格拉布斯(Grubbs)準(zhǔn)則等統(tǒng)計方法判斷離群值[6]，在剔除離群值后計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以蠶種檢測為例，在傳統(tǒng)統(tǒng)計方法中，指定值X可以是結(jié)果平均值，能力評定標(biāo)準(zhǔn)差σ可以是經(jīng)驗值，σ值假設(shè)如表6所示。以克卵粒數(shù)項目檢測為例，3個實驗的3個平行樣檢測比對分析評價結(jié)果見表7，3個實驗室的克卵粒數(shù)項目檢測Z值均小于2，表示比對結(jié)果滿意。

表6 家蠶種成品卵各檢測項目σ值設(shè)定

檢測項目克卵粒數(shù)/粒良卵率/%孵化率/%雜交率/%標(biāo)準(zhǔn)差σ100.250.500.50

各實驗室克卵粒數(shù)與克卵粒數(shù)平均值的差值應(yīng)在20粒以內(nèi)，各實驗室良卵率與良卵率平均值的差值應(yīng)在0.50%以內(nèi)，各實驗室孵化率與孵化率平均值的差值應(yīng)在1.00%以內(nèi)，各實驗室雜交率與雜交率平均值的差值應(yīng)在1.00%以內(nèi)，比對結(jié)果才能達到滿意。

表7 家蠶種成品卵克卵粒數(shù)傳統(tǒng)統(tǒng)計法比對結(jié)果

實驗室編號克卵粒數(shù)/粒ABC參加者成績xZ值結(jié)果評價11 5001 5051 5101 505-0.20滿意21 4851 4901 4951 490-1.70滿意31 5201 5251 5301 5251.80滿意

x的平均值X為1 507粒，標(biāo)準(zhǔn)差σ為10粒。

表8 家蠶種成品卵克卵粒數(shù)四分位數(shù)穩(wěn)健統(tǒng)計法比對結(jié)果

實驗室編號克卵粒數(shù)A/?？寺蚜?shù)B/粒標(biāo)準(zhǔn)化和(S)標(biāo)準(zhǔn)化差(D)實驗室間Z比分數(shù)(ZB)實驗室內(nèi)Z比分數(shù)(ZW)結(jié)果評價11 6741 6752 368.46 -0.71 0.22 0.00 滿意21 6691 6712 362.09 -1.41 -0.28 -0.22 滿意31 6851 6842 382.60 0.71 1.35 0.45 滿意41 6831 6792 377.65 2.83 0.96 1.12 滿意…131 6721 6752 367.04 -2.12 0.11 -0.45 滿意中位值1 6731 6712 365.63 -0.71 標(biāo)準(zhǔn)化四分位距8.90 8.52 12.58 3.15 穩(wěn)健變異系數(shù)/%0.53 0.51 最大值1 6851 690最小值1 6661 666極差1924

為直觀地顯示每個實驗室的比對結(jié)果，可根據(jù)表8制作Z比分數(shù)序列圖。圖1按照大小的順序給出每個實驗室的Z比分數(shù)(ZB)，并標(biāo)有實驗室的代碼(因保密要求，不直接提供實驗室名稱)，使每個實驗室能夠很容易地與其它實驗室的結(jié)果進行比較。

圖1 克卵粒數(shù)實驗室間ZB值分布圖

圖1的繪制方法如下：第1步，打開Microsoft Office Excel 2007，將實驗室代碼和ZB值按豎排方式輸入。選中全部輸入內(nèi)容，點擊工具欄右側(cè)“排序和篩選”按鈕，點擊“自定義排序”，在“關(guān)鍵字”中選擇“ZB”，“次序”中選擇“降序”，點擊“確定”；第2步，選中排序后“ZB”列，點擊工具欄“插入”按鈕，點擊“柱形圖”，選擇“二維柱形圖”第一類，在右側(cè)空白區(qū)域彈出草圖。點擊“選擇數(shù)據(jù)”按鈕，彈出“選擇數(shù)據(jù)源”對話框，點擊“編輯”按鈕，選中實驗室代碼列數(shù)字部分，點擊“確定”，再點擊“確定”；第3步，點擊工具欄“布局”按鈕，選擇“數(shù)據(jù)標(biāo)簽”中的“其他數(shù)據(jù)標(biāo)簽選項”，在“類別名稱”前打鉤，去掉“值”前鉤號，點擊“關(guān)閉”；第4步，點擊圖中的橫坐標(biāo)，按鍵盤“刪除”鍵，刪除圖中重復(fù)的實驗室代碼，一張柱狀圖就初步完成了。可以根據(jù)需要，通過選擇“布局”按鈕下方的“圖表標(biāo)題”“坐標(biāo)軸標(biāo)題”“坐標(biāo)軸”來美化柱狀圖。

3 技術(shù)分析和建議

在完成結(jié)果統(tǒng)計評價后，比對試驗組織者應(yīng)結(jié)合比對過程中發(fā)現(xiàn)的問題進行分析，就檢測方法的選擇、檢測過程的質(zhì)量控制、對作業(yè)指導(dǎo)書的理解等方面提出相應(yīng)的改進建議。

一次成功的實驗室間比對試驗，有利于各實驗室發(fā)現(xiàn)問題，找到差距，規(guī)范操作，提高檢測能力，提升客戶的信任度。開展全國蠶種質(zhì)量檢測實驗室間的比對試驗，檢驗并驗證了各實驗室的檢測能力，加強了各實驗室間的交流、經(jīng)驗共享與共同提高，進一步改進并完善了相關(guān)檢測技術(shù)和方法。