裴俊文 魏丹丹 蔣立峰

摘要 目的：通過觀察益氣化瘀散結(jié)方干預(yù)后胃癌SGC-7901細胞PI3K/AKt/mTOR信號通路分子的表達變化，探討益氣化瘀散結(jié)方影響胃癌細胞增殖的作用機制。方法：體外培養(yǎng)SGC-7901細胞，采用益氣化瘀散結(jié)方含藥血清干預(yù)，細胞分為空白血清組及5%、10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組，藥物干預(yù)后，MTT法檢測細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化，Western-blot、Real-time PCR技術(shù)檢測PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表達變化。結(jié)果：與空白血清組比較，不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清均能不同程度抑制SGC-7901細胞的增殖，其中10%，20%更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），時間上以48 h最為明顯;與空白血清組比較，10%，20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組G0/G1期細胞比例明顯升高，S期細胞比例明顯降低（P<0.05）;與空白血清組比較，不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：抑制PI3K/AKt/mTOR信號通路可能是益氣化瘀散結(jié)方抑制胃癌細胞增殖、調(diào)節(jié)胃癌細胞生長周期的重要作用機制之一。

關(guān)鍵詞 胃癌;益氣化瘀散結(jié)方;細胞增殖;細胞周期;PI3K/AKt/mTOR信號通路

Abstract Objective：To observe the expression changes of PI3K/AKt/mTOR signaling pathway molecule of gastric cancer cell line of SGC-7901，and to explore the mechanism of Yiqi Huayu Sanjie Decoction on affecting the proliferation of gastric cancer cells.Methods：SGC-7901 cells were cultured in vitro and treated with drug-containing serum of Yiqi Huayu Sanjie Decoction.Cells were divided into a blank serum group，5%，10%，20% of drug-containing serum of Yiqi Huayu Sanjie Decoction groups.After drug intervention，the cell proliferation was detected by MTT，the cell cycle change was detected by flow cytometry，the protein and mRNA expression of PI3K，AKT and mTOR were detected by Western-blot and Real-time PCR.Results：Compared with the blank serum group，different concentration of Yiqi Huayu Sanjie Decoction could inhibit the proliferation of SGC-7901 cells to some degree，in which 10% and 20% concentration were especially significant and the difference was statistically significant（P<0.05）.The most obvious time was 48 h; compared with the blank serum group，the proportion of cells in the G0/G1 phase increased and S phase decreased significantly in 10% and 20% concentration of Yiqi Huayu Sanjie Decoction group drug-containing serum group（P<0.05）; compared with the blank serum group，the expression of PI3K，AKT，mTOR protein and mRNA in serum of different concentration of Yiqi Huayu Sanjie Decoction were significantly decreased，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Inhibition of PI3K/AKt/mTOR signaling pathway may be one of the important mechanisms of Yiqi Huayu Sanjie Decoction on inhibiting the proliferation and regulating the growth cycle of gastric cancer cells.

Keywords Gastric cancer; Yiqi Huayu Sanjie Decoction; Proliferation; Cell cycle; PI3K/AKt/mTOR signal path

中圖分類號：R242;R285.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.003

胃癌（Gastric Cancer，GC）是世界上第4大最常見的癌癥，也是全球第2大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。根治術(shù)后早期胃癌預(yù)后良好，而由于早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)胃癌被診斷時已為晚期，導(dǎo)致5年生存率極低。在西方發(fā)達國家，胃癌的5年生存率為10%～19%[2-3]。我國胃癌的發(fā)病率和死亡率在各種惡性腫瘤中均居首位，每年新發(fā)病例約40萬，占世界總發(fā)病病例數(shù)的42%。因此，胃癌的治療極具挑戰(zhàn)性[4-5]。研究表明，PI3K/AKT/ m TOR信號通路在介導(dǎo)胃癌細胞生長、增殖、代謝、生存和血管生成中有重要的作用[3，5-6]。中醫(yī)藥在改善胃癌等腫瘤患者臨床癥狀、提高生命質(zhì)量、實現(xiàn)帶瘤生存以及改善化療不良反應(yīng)等方面的作用已逐漸得到公認。本研究通過實驗觀察臨床治療胃癌的有效驗方益氣化瘀散結(jié)方對胃癌細胞株SGC-7901的影響，并通過PI3K/AKt/mTOR信號通路分子的變化，以探討益氣化瘀散結(jié)方調(diào)控胃癌細胞周期和增殖分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠20只，購于河南省實驗動物中心，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（豫）2018-0014，體質(zhì)量180～220 g，動物飼養(yǎng)于溫度23～26 ℃，濕度40%～70%，光暗周期12/12 h的動物房中，自由攝取飼料、飲水。所有實驗流程均經(jīng)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院動物研究倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：2018033004）。

1.1.2 藥物

益氣化瘀散結(jié)方含藥血清制備：20只大鼠按體質(zhì)量隨機分為益氣化瘀散結(jié)方組和空白對照組，每組10只。益氣化瘀散結(jié)方由黨參15 g、白術(shù)10 g、黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、川芎15 g、桃仁12 g、紅花12 g、夏枯草15 g、土鱉蟲9 g、炙甘草9 g組成。藥物來源于河南省腫瘤醫(yī)院中藥房。益氣化瘀散結(jié)方給藥劑量按照成人臨床等效劑量換算（正常人體質(zhì)量按照70 kg，人與大鼠體表面積系數(shù)為6.3）灌胃12.6 g/kg，空白對照組灌胃等量蒸餾水。2次/d，連續(xù)4 d。最后1次灌胃1 h后用水合氯醛麻醉，采用無抗凝劑真空采血管從腹主動脈取血。室溫靜置2 h，3 500 r/min離心半徑8 cm，離心20 min，同組分離的血清一塊混勻，經(jīng)恒溫水浴56 ℃滅活30 min，在超凈臺用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，分裝，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器

人GC細胞株SGC-7901由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗室惠贈。RPMI-1640細胞培養(yǎng)基（Solarbi公司，貨號：31800-500）、胎牛血清（Hyclone公司，美國，貨號：SV30087.02）;MTT（Solarbio公司，貨號：M8180）、二甲基亞砜（Sigma公司，美國，貨號：D2650），胰蛋白酶（Solarbio公司，貨號：T1320）;PI3K抗體（CST公司，美國，貨號：4249）、AKT抗體（CST公司，美國，貨號：4691）、mTOR抗體（CST公司，美國，貨號：2983）、β-actin抗體（CST公司，美國，貨號：4970）、羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美國，貨號：sc-2357）;RNA提取試劑盒（TIANGEN公司，貨號：DP430）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme公司，貨號：R211-01）;SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒（Qiagen公司，美國，貨號：208054）;細胞周期檢測試劑盒（BD公司，美國，貨號：340242）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

SGC-7901細胞生長至對數(shù)生長期，消化，種至96孔板，分為空白對照組、5%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組、10%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組。

1.2.2 給藥方法

空白對照組采用空白鼠血清干預(yù)，實驗組分別采用5%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清、10%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清干預(yù)。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 1）不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清對SGC-7901細胞活性和增殖的影響：SGC-7901細胞生長至對數(shù)生長期，消化，種至96孔板，分為5%、10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組（實驗組）和空白對照組，空白對照孔采用空白鼠血清。分別培養(yǎng)一定時間（12 h、24 h、48 h、72 h）后，MTT法檢測細胞增殖率。2）流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期：胰酶消化細胞后，用冷PBS洗細胞2次，每次1 000 r/min離心半徑8 cm，離心5 min;棄上清留大約50 μL液體以防止碰到細胞團，加入1 mL Buffer Solution并低速混勻細胞，1 000 r/min離心半徑8 cm，離心5 min，洗滌2～3次;最后1次洗完后，加入1 mL Buffer Solution重懸細胞，計數(shù)，用Buffer Solution調(diào)整細胞密度為1×106個/mL;取0.5 mL含細胞5×105個，每管加Solution A 250 μL，用手輕拍混勻（勿用漩渦混勻）;室溫放置10 min，保留Solution A，再加Solution B 200 μL，輕輕混勻，室溫孵育10 min，保留Solution A+B;加預(yù)冷Solution C 200 μL，輕輕混勻，2～8 ℃避光孵育10 min;最后用50 μm尼龍網(wǎng)過濾細胞，上流式細胞儀分析。3）Western-blot技術(shù)檢測各組細胞PI3K、AKT、mTOR的蛋白表達：消化收集各組細胞，PBS 1 000 r/min離心半徑8 cm，離心5 min，洗滌細胞2次，用RIPA裂解液（按1%的比例加PMSF）裂解細胞，1 000 r/min離心半徑8 cm，離心10 min提取細胞總蛋白。按照BCA法進行蛋白定量，將各蛋白樣品調(diào)整至一致濃度。根據(jù)實驗取適量蛋白樣品，按照4∶1的比例加入5×SDS上樣緩沖液，混勻后95 ℃加熱3～5 min，使蛋白變性。將變性的蛋白加入制好的SDS凝膠孔中，采用恒壓法進行電泳，濃縮膠100 V、分離膠80 V。電泳結(jié)束后，取出凝膠，確定目的條帶的大致位置后，將多余的凝膠切除，裁取比目的凝膠稍大的PVDF膜，甲醇中浸泡5 min，然后按照膠、濾紙、膜的順序，其中膠在負極（黑的一面），于4 ℃環(huán)境下200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜完后取出PVDF膜，于5%脫脂奶粉中，搖床封閉1～2 h。用封閉液稀釋抗體（PI3K、AKT、mTOR、β-actin，稀釋比例參考抗體說明書），膜在抗體中4 ℃孵育過夜。棄一抗，TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入稀釋后的二抗于室溫下孵育1 h。TBST洗膜3次，5 min/次，加ECL發(fā)光液，室溫孵育3～5 min，用Western Blot掃膜儀采集膜上的蛋白條帶，并分析計算各條帶的灰度值。4）Real time PCR技術(shù)檢測細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA的表達：根據(jù)Gen Bank靶基因序列設(shè)計引物，以GAPDH為內(nèi)參，均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。GAPDH序列：上游TCGGAGTCAACGGATTTGGT，下游TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC，產(chǎn)物181 bp。PI3K序列：上游AGATCGCTCTGGCCTCATTG，下游TCCAGGTCATCCCCAGAGTT，產(chǎn)物150 bp。AKT序列：上游AGCCTGGGTCAAAGAAGTCA，下游TACTCCCCTCGTTTGTGCAG，產(chǎn)物195 bp。mTOR序列：上游AAGCCGCGCGAACCTC，下游CTGGTTTCCTCATTCCGGCT，產(chǎn)物134 bp。消化收集各組細胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，然后采用SYBR-Green熒光定量試劑盒，羅氏480實時熒光定量PCR儀檢測各組細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA表達，采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，其中計數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣化瘀散結(jié)方含藥血清對SGC-7901細胞增殖的抑制作用比較

與空白對照組比較，5%、10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清均能不同程度的抑制SGC-7901的增殖，其中以10%、20%含藥血清抑制作用明顯（P<0.05）;在時間上，隨著時間延長，益氣化瘀散結(jié)方含藥血清對SGC-7901細胞增殖的抑制作用逐漸增強，48 h達到高峰，至72 h已經(jīng)下降。因此本研究后續(xù)實驗以48 h為各濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清干預(yù)時間。見表1。

2.2 益氣化瘀散結(jié)方對SGC-7901細胞周期的影響

用流式細胞術(shù)檢測各組細胞的周期分布情況，結(jié)果顯示，與空白血清組和5%含藥血清組比較，10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組G0/G1期細胞比例明顯升高，S期細胞比例明顯降低（P<0.05）。見表2。

2.3 益氣化瘀散結(jié)方對SGC-7901細胞PI3K、AKT、mTOR蛋白表達的影響

利用β-actin作為內(nèi)參計算PI3K、AKT、mTOR蛋白在各組細胞中的相對表達量。結(jié)果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清均能下調(diào)PI3K、AKT、mTOR蛋白的表達（P<0.05）;不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組間比較，5%含藥血清組PI3K、AKT、mTOR蛋白相對表達量高于10%、20%含藥血清組（P<0.05）。見表3，圖1。

2.4 益氣化瘀散結(jié)方對SGC-7901細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA表達的影響

以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法分析比較各組細胞目的基因變化。結(jié)果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清均能下調(diào)PI3K、AKT、mTOR mRNA的表達;不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組間比較，5%含藥血清組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量高于10%、20%含藥血清組見表4。

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號通路是腫瘤細胞增殖和存活的重要通路，參與胃癌細胞的增殖、周期、轉(zhuǎn)移和耐藥性[7]。研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路在胃癌組織中異常表達，其表達明顯高于癌旁組織[8-9]。AKT是炎性反應(yīng)和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵蛋白，其表達和激活可促進胃癌發(fā)生，胃癌組織中磷酸化AKT水平高于周圍非腫瘤組織，且其水平與腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段顯著相關(guān)[12]。AKT參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制與端粒酶活性、核因子κB激活、缺氧誘導(dǎo)因子1等相關(guān)，可作為胃腸癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物和胃癌治療的分子靶點[10-11]。mTOR是AKT下游的重要靶點，參與調(diào)節(jié)許多致癌和代謝事件的關(guān)鍵點，調(diào)節(jié)細胞自噬和細胞生長抑制。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR的激活受PI3K/AKT、MAPK、ERK1/2等調(diào)控，磷酸化后促進下游靶點如p70-S6激酶（p70S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1），導(dǎo)致腫瘤進展[13]。

中醫(yī)藥在穩(wěn)定胃癌病灶、改善患者生命質(zhì)量、延長患者生存期等方面都已得到肯定。研究表明，中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路影響胃癌的發(fā)生發(fā)展與預(yù)后。張逸絨研究發(fā)現(xiàn)，胃癌Ⅰ號方可明顯抑制SGC-7901細胞的增殖和遷移，并將SGC-7901細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，其抗腫瘤作用可能與增加PTEN蛋白的分泌，下調(diào)PI3K/AKT信號通路相關(guān)[14]。除胃癌外，在其他腫瘤研究也發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有抑制作用。趙天一研究陽和湯大鼠含藥血清對乳腺癌的實驗發(fā)現(xiàn)，陽和湯能明顯抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖，促進其凋亡，并將細胞周期阻滯于G2/M期，進一步探索其機制發(fā)現(xiàn)，陽和湯可下調(diào)p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達，促進PTEN蛋白的表達[15]。

中醫(yī)學(xué)認為，胃癌的病機多為虛實夾雜，正氣虧虛為本，瘀毒互結(jié)為標(biāo)，本研究采用的益氣化瘀散結(jié)方由黨參、白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、夏枯草、土鱉蟲、炙甘草組成，臨床應(yīng)用顯示，其能能提高患者生命質(zhì)量，改善臨床癥狀體征，同時可抑制早期胃癌腫瘤的生長。本研究顯示，與空白血清組比較，不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清尤其是10%、20%濃度組均能不同程度抑制SGC-7901細胞的增殖。通過對細胞周期的觀察發(fā)現(xiàn)，益氣化瘀散結(jié)方含藥血清尤其是10%、20%濃度組干預(yù)后，能使更多的SGC-7901細胞處于G0/G1，這可能是其抑制SGC-7901細胞增殖的重要機制。通過Western-blot、Real-time PCR對PI3K、AKT、mTOR基因的表達情況進行分析，結(jié)果顯示，與空白血清組比較，不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA表達水平明顯降低，這提示益氣化瘀散結(jié)方抑制胃癌細胞增殖、調(diào)節(jié)胃癌細胞生長周期的作用，可能與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)。

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（2018-11-07收稿 責(zé)任編輯：徐穎）