王梓源，李欣穎，呂俊閣，付萍，孫雪文，李雪晶，譚之磊，賈士儒

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

ε-聚賴(lài)氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)作為一種天然防腐劑具有廣譜抑菌性，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、電子工業(yè)中[1]。但是目前國(guó)內(nèi)對(duì)ε-PL的研究多集中于ε-PL高產(chǎn)菌株的選育[2-3]與應(yīng)用[4-5]方面，對(duì)其詳細(xì)的抑菌機(jī)理了解有限，并且已有大部分報(bào)道是關(guān)于ε-PL對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和酵母的抑菌機(jī)制研究。LIN等[1]研究發(fā)現(xiàn),ε-PL所帶正電荷可中和單增李斯特菌細(xì)胞表面的負(fù)電荷，增加細(xì)胞膜透性，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。BO等[6-7]研究了ε-PL對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的抑菌機(jī)理，發(fā)現(xiàn)抑菌和殺菌機(jī)制均與ε-PL濃度有關(guān)：當(dāng)ε-PL濃度達(dá)到閾值濃度時(shí)，以氈毯模型的作用方式迅速作用于釀酒酵母細(xì)胞膜，使磷脂雙層彎曲穿孔，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡；當(dāng)其濃度低于閾值水平時(shí)，可增加細(xì)胞膜通透性，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞膜功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)中心碳代謝被抑制。程雅文[8]發(fā)現(xiàn)，亞致死濃度的ε-PL可誘導(dǎo)釀酒酵母細(xì)胞中的活性氧迸發(fā)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡早期階段；致死濃度的ε-PL能使細(xì)胞進(jìn)入凋亡后期階段直至死亡。

而關(guān)于ε-PL對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌機(jī)理鮮少報(bào)道，大腸桿菌(Escherichiacoli)是人和多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)常見(jiàn)的腸道共生革蘭氏陰性菌[9]，且廣泛存在于動(dòng)植物產(chǎn)品中[10-11]，肉制品在加工過(guò)程中極易受到E.coli污染，從而引發(fā)食源性疾病[12]。不同的大腸桿菌菌株和不同生長(zhǎng)狀態(tài)的同一菌株對(duì)ε-PL的耐受性不同。ZHANG等[13]研究了ε-PL對(duì)E.coliO157∶H7的抑菌作用，認(rèn)為低劑量(質(zhì)量濃度16 μg/mL)ε-PL能夠破壞O157∶H7細(xì)胞膜的完整性和通透性，從而起到抑菌作用。但對(duì)于某些大腸桿菌，此劑量的ε-PL并無(wú)抑菌效果，需要使用高劑量(質(zhì)量濃度≥50 μg/mL)防腐劑[14]。E.coliTUST006是本課題組從腐敗食品中分離出的菌株，相比于其他E.coli在食品防腐領(lǐng)域中的應(yīng)用更具研究?jī)r(jià)值。因此，本文以E.coliTUST006作為模式菌株，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)旺盛的菌體為研究對(duì)象，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)探究高劑量ε-PL對(duì)E.coliTUST006的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

E.coliTUST006(下文統(tǒng)一簡(jiǎn)寫(xiě)為E.coli)，天津科技大學(xué)生化工程研究室。

1.1.2 主要試劑

鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)(分析純)、N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, NPN)(分析純)，生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母粉(分析純)，英國(guó)OXOID；胰蛋白胨(分析純)、NaCl(分析純)、NaOH(分析純)、戊二醇(色譜純)，天津市化學(xué)試劑一廠(chǎng)；ε-PL(純度≥ 99%)，浙江新銀象生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L和NaCl 10 g/L，5 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0～7.2。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.0%～2.0%的瓊脂。所有培養(yǎng)基均121 ℃，1×105Pa滅菌20 min。

磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)：KH2PO40.24 g/L，Na2HPO41.44 g/L，NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，濃HCl調(diào)pH至7.4。

PUM(phosphate-urea-magnesium)緩沖液：K2HPO4·3H2O 22.2 g/L，KH2PO47.26 g/L，MgSO40.2 g/L，尿素1.8 g/L，濃HCl調(diào)pH至7.1。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(U mini-1240)，日本SHIMADZU公司；電導(dǎo)率儀(FE30)，瑞士METTLER TOLEDO公司；掃描電子顯微鏡(SU1510)，日本日立公司；激光粒徑測(cè)定儀(BI-90Plus)，美國(guó)BROOKHA EN儀器設(shè)備公司；熒光分光光度計(jì)(F-7000)，日本Hitachi公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 指示菌的活化

取一環(huán)斜面培養(yǎng)保存的E.coli接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，使初始細(xì)胞密度OD600為0.02，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.2，備用。

1.3.2 抑菌曲線(xiàn)的測(cè)定

將不同質(zhì)量濃度的ε-PL溶液分別加入到活化的E.coli菌液中，使ε-PL終質(zhì)量濃度分別為0、50、100、150、200和250 μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)10 h，每間隔1 h測(cè)定E.coli細(xì)胞OD600值，取3次測(cè)量值的平均值繪制抑菌曲線(xiàn)。

1.3.3 細(xì)胞存活率的測(cè)定

將不同質(zhì)量濃度的ε-PL溶液分別加到活化的E.coli菌液中，使ε-PL終質(zhì)量濃度分別為0、50、100和150 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，并在2和4 h取一定量的菌液，采用稀釋涂布平板法，計(jì)算菌落數(shù)，每組設(shè)3個(gè)平行。按公式(1)計(jì)算E.coli細(xì)胞存活率:

(1)

1.3.4 ε-PL對(duì)E.coli細(xì)胞表面疏水性的影響

采用微生物黏著碳?xì)浠衔锓y(cè)定E.coli細(xì)胞的表面疏水性[15]。將E.coli培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，4 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用PUM緩沖液洗滌并重懸，使菌懸液OD600值為0.5。取3 mL菌懸液分別加入等體積的質(zhì)量濃度為100、200和300 μg/mL的ε-PL溶液，對(duì)照組加入3 mL PUM緩沖液，37 ℃水浴培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第2和4 h取樣，首先測(cè)定菌液的OD600，再取3 mL上述菌液與400 μL十六烷混合，旋渦振蕩1 min，靜置15 min，取下層水相，用分光光度計(jì)測(cè)其OD600，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。按公式(2)計(jì)算細(xì)菌表面疏水率:

(2)

1.3.5 ε-PL對(duì)E.coli菌懸液電導(dǎo)率的影響

取適量指示菌，參考KONG等[16]的方法并稍作改進(jìn)，測(cè)定E.coli菌懸液的電導(dǎo)率值，從而確定金屬離子滲出變化趨勢(shì)。將E.coli培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，4 000 r/min離心5 min收集菌體細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為50 g/L的葡萄糖溶液洗滌并重懸。將上述菌懸液在沸水浴中處理5 min，測(cè)得的電導(dǎo)率計(jì)為σ0；分別將不同質(zhì)量濃度的ε-PL溶液與等體積的質(zhì)量濃度為50 g/L葡萄糖溶液或上述菌懸液混合，使ε-PL的終質(zhì)量濃度為50、100和150 μg/mL，37 ℃水浴搖床培養(yǎng)，測(cè)得的電導(dǎo)率分別計(jì)為σ1、σ2。各組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。按公式(3)計(jì)算混合體系的相對(duì)電導(dǎo)率:

(3)

1.3.6E.coli內(nèi)膜通透性的測(cè)定

以O(shè)NPG為反應(yīng)底物測(cè)定β-半乳糖苷酶活性變化，能夠反映ε-PL對(duì)E.coli內(nèi)膜通透性的影響。使用含有20 g/L乳糖的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)E.coli，4 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，重懸于5 g/L NaCl溶液中，使菌懸液OD600值為0.4，如未特殊說(shuō)明，以下實(shí)驗(yàn)所用菌懸液獲得方法均與上述相同。將1.5 mL不同質(zhì)量濃度的ε-PL與1.5 mLE.coli菌懸液、150 μL 30 mmol/L ONPG溶液混合后，立即測(cè)定體系在420 nm波長(zhǎng)處的吸光值。在第60、90和120 min各記錄1次數(shù)據(jù)，各組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

1.3.7E.coli外膜通透性的測(cè)定

采用NPN法測(cè)定ε-PL對(duì)E.coli細(xì)胞外膜通透性的影響[17]。分別取1.5 mL質(zhì)量濃度為0、50、100和150 μg/mL的ε-PL溶液與20 μL 1 mmol/L的NPN溶液混合，用熒光分光光度計(jì)分別在激發(fā)波長(zhǎng)350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)420 nm下檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，然后在上述溶液中加入1.5 mL菌懸液再次檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，直至熒光強(qiáng)度不再增加，2次所測(cè)熒光強(qiáng)度之差即為相對(duì)熒光強(qiáng)度，各組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

1.3.8 細(xì)菌菌體紫外吸收物的滲透檢測(cè)

分別取1.5 mL菌懸液加入等體積不同質(zhì)量濃度的ε-PL，對(duì)照組加入等體積蒸餾水，使得ε-PL終質(zhì)量濃度達(dá)到50、100和150 μg/mL。以加入ε-PL為起點(diǎn)，分別在培養(yǎng)的第2和4 h用紫外分光光度計(jì)測(cè)量菌懸液在260和280 nm波長(zhǎng)處的吸光值，各組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

1.3.9 掃描電鏡觀察E.coli細(xì)胞形態(tài)

參考SHIMADA等[18]方法，將收集的菌體用9 g/L NaCl溶液洗滌，重懸于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中，于4 ℃冰箱靜置4 h。4 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀分別用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%和90%的乙醇進(jìn)行梯度脫水5 min，最后用純乙醇重懸。取一定量適宜濃度的樣品滴加到蓋破片上，晾干。用導(dǎo)電膠將樣品粘貼在金屬樣品臺(tái)上，真空鍍膜，使用掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察。

1.3.10 ε-PL對(duì)E.coli菌體聚集程度的分析

將E.coli培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入ε-PL溶液，使其終質(zhì)量濃度分別為0、50、100和150 μg/mL，以加入ε-PL的時(shí)間為零點(diǎn)，分別在2和4 h取樣，使用粒徑分布儀測(cè)定菌體粒徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的ε-PL對(duì)E. coli的抑菌曲線(xiàn)

由圖1可知，對(duì)照組E.coli在延滯期后，快速生長(zhǎng)，而ε-PL可抑制E.coli生長(zhǎng)，且這種作用呈濃度依賴(lài)性，抑制效果與ε-PL質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。質(zhì)量濃度100 μg/mL的ε-PL就能夠有效抑制E.coli生長(zhǎng)，至培養(yǎng)終點(diǎn)OD600約為對(duì)照組的一半，而ε-PL質(zhì)量濃度≥150 μg/mL時(shí)，OD600幾乎沒(méi)有增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)中的菌液也接近澄清，說(shuō)明此時(shí)ε-PL幾乎能夠完全抑制E.coli生長(zhǎng)。這表明ε-PL發(fā)揮抑菌作用需要一定的閾值濃度。

2.2 ε-PL對(duì)E. coli存活率的影響

由圖2可知，ε-PL可以明顯降低E.coli的存活率，且這種效果與ε-PL的質(zhì)量濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)。經(jīng)50 μg/mL ε-PL處理2 h后，E.coli的細(xì)胞存活率為47.98%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其存活率進(jìn)一步降低；經(jīng)100、150 μg/mL ε-PL處理2 h后，E.coli存活率分別下降至37.19%和14.88%，作用4 h后E.coli的細(xì)胞存活率分別為21.18%和5.61%，說(shuō)明此時(shí)150 μg/mL ε-PL幾乎能夠完全抑制E.coli生長(zhǎng)，此結(jié)論與抑菌曲線(xiàn)結(jié)果一致。

圖1 ε-PL對(duì)E. coli的抑菌曲線(xiàn)Fig.1 The time-kill cur e of ε-PL against E. coli

圖2 ε-PL對(duì)E. coli存活率的影響Fig.2 The effect of ε-PL on the sur i al rate of E. coli

2.3 ε-PL對(duì)E. coli細(xì)胞表面疏水性的影響

ε-PL對(duì)E.coli細(xì)胞表面疏水性的影響如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)ε-PL處理后，E.coli細(xì)胞表面疏水性明顯上升。質(zhì)量濃度50、100和150 μg/mL的ε-PL作用2 h后，細(xì)胞疏水率分別為17.1%、20.3%和34.1%；作用4 h后，疏水率分別為11.4%、7.5%和23.5%。以上結(jié)果說(shuō)明，ε-PL能夠明顯增大E.coli細(xì)胞表面疏水性。此細(xì)胞表面疏水性增大的現(xiàn)象與薄濤等[19]研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)镋.coli表面疏水性與細(xì)胞壁中脂多糖含量密切相關(guān)，細(xì)胞壁中的脂多糖含量越低，E.coli細(xì)胞表面疏水性越強(qiáng)。而ε-PL帶有正電荷，可與E.coli外膜上帶負(fù)電荷的脂多糖通過(guò)靜電作用相結(jié)合，破壞脂多糖的結(jié)構(gòu)，因此導(dǎo)致E.coli細(xì)胞表面疏水性增大。

2.4 ε-PL對(duì)E. coli菌懸液電導(dǎo)率的影響

當(dāng)微生物細(xì)胞處于不利環(huán)境中，其生物膜流動(dòng)性降低，半透性喪失，胞內(nèi)的K+、Na+等電解質(zhì)大量外泄，導(dǎo)致菌懸液體系電導(dǎo)率升高。因此，通過(guò)檢測(cè)菌懸液的電導(dǎo)率來(lái)推測(cè)細(xì)胞受損情況。結(jié)果如圖4所示，ε-PL處理后E.coli菌懸液的電導(dǎo)率明顯增大，特別是經(jīng)150 μg/mL ε-PL處理4 h后，E.coli菌懸液的電導(dǎo)率遠(yuǎn)高于未經(jīng)處理的對(duì)照組。說(shuō)明菌懸液電導(dǎo)率增大的現(xiàn)象隨著ε-PL質(zhì)量濃度升高而愈發(fā)明顯。此現(xiàn)象與何靜如等[20]研究的(-)-β-蒎烯對(duì)沙門(mén)氏菌菌液電導(dǎo)率影響的結(jié)果較為類(lèi)似。這可能是由于在ε-PL的作用下，E.coli細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，原生質(zhì)外泄，導(dǎo)致E.coli胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞，進(jìn)而起到抑菌作用。

圖3 ε-PL對(duì)E. coli細(xì)胞表面疏水性的影響Fig.3 The effect of ε-PL on the cell surface hydrophobicity of E. coli

圖4 ε-PL對(duì)E. coli菌懸液電導(dǎo)率的影響Fig.4 The effect of ε-PL on the relati e conducti ity of E. coli suspension

2.5 ε-PL對(duì)E. coli內(nèi)膜通透性的影響

當(dāng)E.coli內(nèi)膜遭到破壞時(shí)，其胞內(nèi)β-半乳糖苷酶會(huì)透過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜泄漏出來(lái)，檢測(cè)β-半乳糖苷酶含量變化可以推測(cè)E.coli內(nèi)膜通透性的變化[21]。如圖5所示，在ε-PL作用下，E.coli菌懸液在420 nm波長(zhǎng)處的吸光值與對(duì)照組相比明顯增大，說(shuō)明ε-PL作用下E.coli胞內(nèi)β-半乳糖苷酶大量泄漏，即ε-PL能夠破壞E.coli細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致E.coli生長(zhǎng)受到抑制直至死亡。此結(jié)論與蔣佳佳等[21]研究的氧化石墨烯納米銀復(fù)合材料對(duì)E.coli細(xì)胞內(nèi)膜的影響結(jié)果相似。

圖5 ε-PL對(duì)E. coli內(nèi)膜透性的影響Fig.5 The effect of ε-PL on the inner membrane penetrating acti ity of E. coli

2.6 ε-PL對(duì)E. coli外膜透性的影響

菌懸液熒光強(qiáng)度與E.coli外膜被破壞程度呈正相關(guān)，如圖6所示，對(duì)照組菌懸液的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間無(wú)明顯變化，一直維持在較低水平，而經(jīng)不同質(zhì)量濃度ε-PL處理后的實(shí)驗(yàn)組菌懸液熒光吸收值，在20～40 min內(nèi)迅速增加，在40 min后趨于平緩。并且，隨著ε-PL質(zhì)量濃度升高，菌懸液的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增加。說(shuō)明ε-PL對(duì)E.coli細(xì)胞外膜具有破壞作用，且破壞作用與ε-PL質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。E.coli外膜滲透性也與脂多糖結(jié)構(gòu)有著密切聯(lián)系[22]，因此，ε-PL對(duì)E.coli細(xì)胞外膜破壞作用的原因與ε-PL使E.coli細(xì)胞表面疏水性增大的原因是一致的，即ε-PL同E.coli表面的脂多糖通過(guò)靜電作用結(jié)合，改變或破壞E.coli的外膜結(jié)構(gòu)，最終造成E.coli死亡。

圖6 ε-PL對(duì)E. coli外膜透性的影響Fig.6 The effect of ε-PL on the outer membrane penetrating acti ity of E. coli

2.7 細(xì)菌菌體紫外吸收物的滲透檢測(cè)

核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子貫穿于整個(gè)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)之中，是細(xì)胞的重要組成結(jié)構(gòu)，E.coli細(xì)胞膜被破壞時(shí)，核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)就會(huì)泄漏到胞外[23]。據(jù)此，檢測(cè)菌懸液在260和280 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，能夠了解細(xì)胞膜受損情況。由圖7和圖8可知，ε-PL可以促進(jìn)E.coli核酸和胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明ε-PL能夠破壞E.coli細(xì)胞膜，進(jìn)而導(dǎo)致菌體的死亡，與ε-PL對(duì)E.coli細(xì)胞表面疏水率、內(nèi)外膜透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖7 ε-PL對(duì)E. coli胞內(nèi)核酸滲漏的影響Fig.7 The effect of ε-PL on the leakage of intracellular nucleic acid of E. coli

圖8 ε-PL對(duì)E. coli胞內(nèi)蛋白質(zhì)滲漏的影響Fig.8 The effect of ε-PL on the leakage of intracellular protein of E. coli

2.8 SEM觀察結(jié)果

如圖9所示，未經(jīng)ε-PL處理的E.coli細(xì)胞表面光滑、形態(tài)飽滿(mǎn)，未有細(xì)胞破損現(xiàn)象(圖9-a)。經(jīng)50、100 μg/mL ε-PL處理2 h后E.coli細(xì)胞間出現(xiàn)明顯的聚團(tuán)黏連現(xiàn)象，部分細(xì)胞表面出現(xiàn)凹陷，凸起(圖9-b和9-c)，且隨著ε-PL質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞表面變得粗糙皺縮、無(wú)飽滿(mǎn)感，細(xì)胞間聚團(tuán)黏連明顯。上述質(zhì)量濃度下的ε-PL處理4 h與2 h相比，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。而經(jīng)150 μg/mL ε-PL處理2 h后，菌體表面出現(xiàn)大量微膠粒(圖9-d)，4 h后大部分菌體破裂塌陷，出現(xiàn)大量孔洞(圖9-h)，此時(shí)E.coli可能已喪失生存能力。此結(jié)論說(shuō)明ε-PL具有破壞E.coli細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用，與上述細(xì)胞膜疏水性及滲透性、紫外吸收物的滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

目前，根據(jù)抗菌肽是否會(huì)對(duì)細(xì)胞膜的完整性造成損傷或能否進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，將其分為細(xì)胞膜損傷機(jī)制和非膜損傷機(jī)制。在本研究中，SEM觀察結(jié)果表明，ε-PL抑菌活性是通過(guò)膜損傷機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。在膜損傷機(jī)制中，關(guān)于桶板模型、環(huán)孔機(jī)制模型和氈毯模型的研究較為成熟[24]。在桶板模型中，抗菌肽是在不引起磷脂雙分子層彎曲的情況下直接插入細(xì)胞膜內(nèi)，并通過(guò)抗菌肽分子間的疏水區(qū)域接觸細(xì)胞膜并與之作用[25]。而在環(huán)孔機(jī)制模型中抗菌肽雖然會(huì)使磷脂雙分子層彎曲，但不會(huì)產(chǎn)生微膠粒。氈毯模型中，抗菌肽通過(guò)靜電作用與磷脂分子中的陰離子頭部結(jié)合，像地毯般覆蓋在細(xì)胞膜表面，當(dāng)抗菌肽的濃度達(dá)到一定程度后，細(xì)胞膜上會(huì)出現(xiàn)瞬時(shí)的孔洞，使得抗菌肽進(jìn)入到細(xì)胞膜內(nèi)，并且隨著磷脂雙分子層的彎曲及受損，細(xì)胞膜逐漸分解，與抗菌肽共同形成微膠團(tuán)[26-28]。

a-0 μg/mL ε-PL處理2 h; b-50 μg/mL ε-PL處理2 h; c-100 μg/mL ε-PL處理2 h; d-150 μg/mL ε-PL處理2 h; e-0 μg/mL ε-PL處理4 h; f-50 μg/mL ε-PL處理4 h; g-100 μg/mL ε-PL處理4 h; h-150 μg/mL ε-PL處理4 h圖9 不同濃度ε-PL處理后E. coli的SEM圖Fig.9 The effect of ε-PL on the morphology of E. coli by SEM

在本研究中，經(jīng)ε-PL處理后的E.coli形態(tài)出現(xiàn)不同程度的變化，可以明顯觀察到細(xì)胞表面粗糙、菌體出現(xiàn)孔隙和微膠粒以及磷脂雙分子層彎曲。因此，ε-PL對(duì)E.coli的抑菌作用可能是通過(guò)氈毯模型中所描述的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

2.9 ε-PL對(duì)E. coli菌體聚集程度的影響

為進(jìn)一步探究ε-PL處理后E.coli細(xì)胞間的黏連聚團(tuán)現(xiàn)象，利用粒徑儀測(cè)定菌懸液的菌團(tuán)粒徑。由圖10可知，未經(jīng)ε-PL處理的E.coli菌團(tuán)粒徑分布為0.5～1.5 μm(圖10-b)，與何國(guó)慶等[29]報(bào)道的E.coli菌體大小一致，說(shuō)明菌體間相互均勻分散，幾乎未發(fā)生聚團(tuán)。而經(jīng)50、100和150 μg/mL ε-PL處理后E.coli的菌團(tuán)粒徑分別為10～40 μm(圖10-c)、40～80 μm(圖10-d)和80～200 μm之間(圖10-e)，說(shuō)明經(jīng)ε-PL處理后E.coli菌團(tuán)粒徑明顯大于未經(jīng)ε-PL處理的對(duì)照組，并且其粒徑隨ε-PL質(zhì)量濃度升高而增大，即ε-PL會(huì)使E.coli菌體發(fā)生團(tuán)聚，該結(jié)果與SEM觀察結(jié)果一致。

a-不同質(zhì)量濃度ε-PL對(duì)E. coli菌懸液粒徑的影響對(duì)比圖；b-0 μg/mL的ε-PL處理2 h；c-50 μg/mL的ε-PL處理2 h；d-100 μg/mL的ε-PL處理2 h；e-150 μg/mL的ε-PL處理2 h圖10 ε-PL對(duì)E.coli菌懸液粒徑的影響Fig.10 Effect of ε-PL on the particle size of E.coli suspension

HYLDGAARD等[30]研究表明，對(duì)ε-PL更耐受的E.colirscC突變體莢膜外多糖、莢膜異多糖酸的過(guò)量表達(dá)，有助于調(diào)節(jié)菌體生物膜的三維結(jié)構(gòu)，并起到一定的屏障保護(hù)作用?？赏茰y(cè)本研究中ε-PL作用后E.coli菌體發(fā)生團(tuán)聚，可能是因?yàn)镋.coli受到ε-PL刺激后分泌大量黏性多糖以抵御ε-PL的破壞作用。另一方面， AARA等[31]發(fā)現(xiàn),ε-PL可吸附在革蘭氏陰性菌的細(xì)胞外膜上，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使膜脂多糖被釋放。所以本研究中引起菌體團(tuán)聚的物質(zhì)也有可能是E.coli細(xì)胞膜遭到ε-PL破壞后，釋放出來(lái)的脂多糖。此外，由于ε-PL是一種陽(yáng)離子抗菌肽，本身帶有一定的正電荷，而E.coli帶有負(fù)電荷，因此,ε-PL還可能通過(guò)靜電吸附作用使E.coli菌體相互黏連，即ε-PL作為一種黏連劑將菌體黏連在一起。

3 結(jié)論

本文以E.coli為模式菌株，通過(guò)一系列抑菌實(shí)驗(yàn)，揭示了ε-PL的抑菌機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ε-PL對(duì)E.coli的抑菌活性具有劑量依賴(lài)性，與ε-PL的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當(dāng)ε-PL質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí),有明顯抑菌效果。進(jìn)一步研究表明，ε-PL能夠增強(qiáng)E.coli細(xì)胞表面的疏水性、內(nèi)膜及外膜的通透性，并且改變E.coli細(xì)胞膜內(nèi)外電勢(shì)，使得其細(xì)胞內(nèi)容物如核酸、蛋白質(zhì)等大量滲出。此外，SEM圖顯示ε-PL作用后E.coli細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞、微膠團(tuán)。上述結(jié)果說(shuō)明ε-PL能夠破壞E.coli的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑菌效果。ε-PL對(duì)E.coli的作用類(lèi)似于抗菌肽抑菌機(jī)制中的氈毯模型所描述的模式，即ε-PL首先通過(guò)靜電作用與細(xì)胞膜結(jié)合，鋪滿(mǎn)細(xì)胞膜表面，使E.coli細(xì)胞磷脂雙分子層彎曲受損，細(xì)胞膜逐漸分解，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如電解質(zhì)、胞內(nèi)核酸與蛋白質(zhì)釋放，進(jìn)而導(dǎo)致菌體死亡。研究還發(fā)現(xiàn)，ε-PL處理后E.coli菌體會(huì)發(fā)生聚團(tuán)黏連現(xiàn)象，且隨ε-PL質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞團(tuán)聚愈發(fā)明顯。本文的研究結(jié)果對(duì)于ε-PL更好地應(yīng)用于食品防腐領(lǐng)域具有一定指導(dǎo)價(jià)值，對(duì)ε-PL對(duì)其他微生物抑菌機(jī)制的研究也具有一定參考價(jià)值。