周勝虎，毛銀，鄧禹*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學,江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫,214122)

近年來，隨著合成生物技術(shù)、代謝工程和系統(tǒng)生物學的快速發(fā)展與交叉融合，微生物發(fā)酵合成高附加值化學品得到了長足的進步[1-2]。在此過程中，構(gòu)建高效的細胞工廠始終是研究的核心。細胞工廠的傳統(tǒng)改造策略主要包括：過表達途徑基因、敲除或抑制產(chǎn)物降解途徑和競爭性代謝途徑、蛋白質(zhì)工程改造限速酶和定向進化強化菌株生產(chǎn)性能等[3-4]。這些改造策略的核心思想是最大化的引導細胞內(nèi)的物質(zhì)和能量流向產(chǎn)物合成方向，同時強化產(chǎn)物合成途徑的代謝通量。經(jīng)過上述改造策略已經(jīng)實現(xiàn)了多類重要化合物的高效合成，例如黃酮類化合物[5-6]、脂肪酸[7-8]、萜類化合物[9-11]、生物燃料[12-14]、聚合物單體化合物[15-16]等。然而，隨著底物消耗、副產(chǎn)物積累和產(chǎn)物合成，發(fā)酵過程中的環(huán)境始終處于不斷變化的過程中，這導致基因表達水平不能隨時與環(huán)境變化相適應，因此僅僅通過簡單的靜態(tài)代謝工程改造難以使細胞適應復雜多變的發(fā)酵環(huán)境[17]。此外，發(fā)酵系統(tǒng)中每個單細胞的生長狀態(tài)都不相同，通過統(tǒng)一調(diào)節(jié)發(fā)酵條件(pH、溫度和碳源等)或者添加誘導劑(異丙基-β-D-硫代半糖苷等)的方式改變基因表達水平并不能使每一個細胞都處于最佳的生長和生產(chǎn)狀態(tài)[18]。發(fā)酵系統(tǒng)中不同位置的細胞所處環(huán)境也不盡相同，這進一步增加了調(diào)控的難度。因此，發(fā)酵過程中環(huán)境變化具有瞬時的空間和時間特性。綜上，為實現(xiàn)目標化合物的高效合成，急需建立一種可在時間和空間水平上針對特定細胞所處的生理生化環(huán)境進行精準控制的調(diào)控手段。

為在發(fā)酵過程中實現(xiàn)時空水平的精準調(diào)控，研究者們設計了大量的生物傳感器用于實時定量監(jiān)測細胞內(nèi)外環(huán)境的變化，同時根據(jù)監(jiān)測信號實時動態(tài)的調(diào)控代謝網(wǎng)絡[19-20]。這些動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡設計的一般思路是以可響應細胞內(nèi)外環(huán)境變化的生物傳感器控制關鍵基因，傳感器根據(jù)檢測到的信號變化強化或抑制基因表達，從而達到代謝流量調(diào)控的目標[17-21]。

本文根據(jù)發(fā)酵過程中代謝調(diào)控的時空尺度不同，將動態(tài)調(diào)控策略分為環(huán)境響應型、胞內(nèi)產(chǎn)物響應型和胞外產(chǎn)物響應型(圖1)。

a-發(fā)酵環(huán)境響應的動態(tài)調(diào)控策略；b-胞內(nèi)產(chǎn)物響應的動態(tài)調(diào)控策略；c-胞外產(chǎn)物響應的動態(tài)調(diào)控策略圖1 時空水平的動態(tài)調(diào)控響應機制Fig.1 The mechanisms of dynamic regulation in spatiotemporal le el

環(huán)境響應型動態(tài)調(diào)控針對整個發(fā)酵系統(tǒng)中所有細胞進行集體調(diào)控(圖1-a)；胞內(nèi)產(chǎn)物響應型動態(tài)調(diào)控基于每個單細胞自身生理生化狀態(tài)而進行自我調(diào)控(圖1-b)；胞外產(chǎn)物響應型動態(tài)調(diào)控的特點是代謝物可分泌出細胞并同時被其他單細胞攝取，這將會造成不同單細胞在空間尺度上的信號干擾(圖1-c)。

本文通過對比當前國內(nèi)外的相關研究，深入分析不同動態(tài)調(diào)控策略的優(yōu)缺點，為更廣泛的代謝工程和發(fā)酵工程應用提供理論參考。

1 發(fā)酵環(huán)境響應的動態(tài)調(diào)控策略

1.1 溫度響應的動態(tài)調(diào)控策略

溫度是發(fā)酵過程中的重要參數(shù)，不僅與能量消耗息息相關，同時也顯著影響著細胞生長、酶的催化活性和產(chǎn)物的穩(wěn)定性。因此，通過溫度來調(diào)控微生物生長與代謝是發(fā)酵過程控制的重要手段。對整個發(fā)酵體系進行加熱或冷卻會影響體系中所有細胞的代謝過程，這種動態(tài)調(diào)控策略忽略了微觀層面上每個單細胞的性能差異性，目標是針對發(fā)酵體系中所有細胞集體的動態(tài)調(diào)控。目前，應用最為廣泛的溫敏型生物傳感器包括CI857阻遏蛋白介導的高溫激活傳感器以及CI434-te S阻遏蛋白突變體(TFts)介導的低溫激活傳感器[22-23]。其中CI857在溫度高于37 ℃時失去活性而無法與結(jié)合位點結(jié)合，進而開啟目標基因表達;當溫度低于30 ℃時，CI857阻遏目標基因表達。而TFts在溫度低于30 ℃時失去活性而無法與結(jié)合位點結(jié)合，進而開啟目標基因表達;當溫度高于37 ℃時，TFts阻遏目標基因表達?；谶@些調(diào)控機制，SUN等[24]構(gòu)建了一個乙醇生產(chǎn)菌株EscherichaicoliB0013-2021 HPA,該菌株的生長繁殖過程僅以木糖、半乳糖和阿拉伯糖為碳源，而乙醇合成過程僅以葡糖糖為碳源。在該工程菌株中，敲除了乙醇的競爭性代謝途徑基因(pta-ackA、ldhA和pflB)，同時突變了葡萄糖的攝取和氧化的必需基因(glk、ptsG和manZ)。在此基礎上以受CI857調(diào)控的啟動子pR/pL調(diào)控ptsG表達，從而達到葡萄糖消耗受溫度控制的目的。在低溫條件下大腸桿菌B0013-2021HPA利用木糖、半乳糖和阿拉伯糖生長，隨后溫度升高到37 ℃后開始利用葡萄糖合成乙醇。經(jīng)過12 h發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量比無動態(tài)調(diào)控菌株提高1.4倍，達到4.06 g/(L·h)。與高溫激活的生物傳感器相比，低溫激活的生物傳感器鮮有報道和應用。最近，ZHENG等[22]在低溫傳感器的設計和應用上獲得了突破性進展。在這項研究工作中，作者首先通過定向進化獲得了受高溫激活的阻遏蛋白TFts、受低溫激活的蛋白酶TEts和MycoplasmaflorumLon蛋白酶(mf-Lon)。經(jīng)過巧妙組合，構(gòu)建了如圖2所示的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。在不同種大腸桿菌中,該系統(tǒng)均具有良好的功能，是目前已知低溫誘導生物傳感器中動態(tài)范圍最廣、本地表達最低和對信號響應速度最快的傳感器。此外，應用該傳感器控制ftsZ和mreB的表達可實現(xiàn)大腸桿菌形態(tài)的動態(tài)控制。

圖2 低溫誘導型生物傳感器工作機制Fig.2 The mechanisms of low temperature induced biosensor注:當溫度低于30 ℃時TFts失去活性，無法阻遏TEts、TetR和目標蛋白GOI的表達，此時TEts特異性的降解TFts蛋白從而進一步強化GOI的表達。當溫度高于37 ℃時TFts阻遏TEts、TetR和目標蛋白GOI的表達，因此mf-Lon得以表達并特異性降解滲漏表達的GOI蛋白。鈍箭頭代表抑制作用。

1.2 pH響應的動態(tài)調(diào)控策略

綜上所述，無論是基于物理環(huán)境(如溫度)還是化學環(huán)境(如pH)的動態(tài)調(diào)控策略都屬于針對發(fā)酵系統(tǒng)全局的動態(tài)調(diào)控。這些策略更加關注環(huán)境因素在時間水平上的波動，而忽略了每個單細胞在空間水平上的不同需求。因為發(fā)酵系統(tǒng)是一個混合體系，在發(fā)酵過程中的任意時間段都存在著大量不同生長時期的細胞、基因表達水平不同的細胞、代謝負擔不同的細胞和生產(chǎn)性能不同的細胞[18]，因此僅僅根據(jù)環(huán)境因素的時間水平對發(fā)酵系統(tǒng)所有細胞進行整體的動態(tài)調(diào)控并不能滿足每個單細胞在空間水平上的需求。

圖3 基于TDAG8的pH響應生物傳感器工作機制Fig.3 The mechanisms of TDAG8 dependent pH-responsi e biosensor

2 胞內(nèi)代謝物響應的動態(tài)調(diào)控策略

為了同時滿足發(fā)酵系統(tǒng)中不同性能的單細胞在時間和空間水平上的不同需求，急需建立一種基于單細胞自身的獨特狀態(tài)進行自我調(diào)節(jié)的動態(tài)調(diào)控策略。胞內(nèi)代謝物僅存在于細胞內(nèi)部，因此能體現(xiàn)每個單細胞獨特的生理狀態(tài)?；谶@些特性，胞內(nèi)代謝物響應的動態(tài)調(diào)控策略可同時實現(xiàn)對單細胞的時間和空間水平上的調(diào)控。

輔酶A(coenzyme A，CoA)及其硫酯化合物是胞內(nèi)典型的代謝中間產(chǎn)物，與胞內(nèi)能量供應和物質(zhì)循環(huán)息息相關[1]。近年來，研究者們建立了多種基于胞內(nèi)丙二酰-CoA和酯酰-CoA含量變化的動態(tài)調(diào)控策略[28]。其中最為經(jīng)典的設計是XU等[29]的乙酰-CoA/丙二酰-CoA振蕩器和ZHANG等[30]的脂肪酸/酯酰-CoA動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)?；诒?CoA的動態(tài)調(diào)控策略主要依賴于受丙二酰-CoA調(diào)控的阻遏蛋白FapR和1個17 bp長度的結(jié)合位點fapO。當胞內(nèi)丙二酰-CoA含量增加后可與FapR結(jié)合形成FapR-丙二酰-CoA復合體，該復合體無法識別fapO，從而無法形成阻遏作用，目標蛋白得以表達[31]。相反，當胞內(nèi)丙二酰-CoA不足時無法形成FapR-丙二酰-CoA復合體，F(xiàn)apR得以與fapO結(jié)合進而阻遏目標基因表達。為了構(gòu)建1個動態(tài)調(diào)控裝置用以實時平衡脂肪酸合成時乙酰-CoA和丙二酰-CoA含量，XU等[29]篩選得到了1個受FapR激活的啟動子Pgap，將該啟動子與受FapR阻遏的啟動子T7-fapO結(jié)合，構(gòu)建得到了乙酰-CoA/丙二酰-CoA振蕩器(圖4-a)。當胞內(nèi)丙二酰-CoA含量不足時該振蕩器激活Pgap表達并阻遏T7-fapO表達，從而分別強化乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丙二酰-CoA和抑制丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化為脂肪酸；當胞內(nèi)丙二酰-CoA含量過高時該振蕩器阻遏Pgap表達并激活T7-fapO表達，從而分別抑制乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丙二酰-CoA和強化丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化為脂肪酸(圖4-b)。為了構(gòu)建1個平衡脂肪酸合成與酯酰-CoA積累的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，ZHANG等[30]首先設計了一個可高效響應胞內(nèi)酯酰-CoA含量的生物傳感器(圖4-c)。該傳感器包括酯酰-CoA響應的阻遏蛋白(FadR)和基于FadR結(jié)合位點構(gòu)建的啟動子組成。當胞內(nèi)酯酰-CoA不足時FadR與識別位點結(jié)合并阻遏目標基因表達；相反，當胞內(nèi)酯酰-CoA含量過高時與FadR結(jié)合形成FadR-酯酰-CoA復合體，從而離開結(jié)合位點同時激活目標基因表達。應用該動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控丙酮酸脫羧酶(pdc)、醇脫氫酶(adhB)、酯酰-CoA合酶(fadD)和蠟酯合酶(atfA)的表達，最終獲得了1.5 g/L的生物柴油產(chǎn)量(圖4-c)。

總之，胞內(nèi)代謝產(chǎn)物響應的生物傳感器由于可專一性的實時監(jiān)測單細胞水平的代謝變化，為單細胞水平的動態(tài)調(diào)控提供了新的思路。然而，在發(fā)酵過程中大多數(shù)代謝產(chǎn)物或中間產(chǎn)物往往可以不同程度地分泌到細胞外，這將會導致細胞間的信號交叉，從而不同程度地影響在單細胞水平上生物傳感器對自身信號的監(jiān)測準確度。

a-丙二酰-CoA振蕩器工作機制,箭頭和鈍箭頭分別代表激活和抑制作用;b-丙二酰-CoA振蕩器工作示意圖，當丙二酰-CoA不足時啟動ACC表達，當丙二酰-CoA充足時啟動FAS表達;c-基于酯酰-CoA的動態(tài)調(diào)控策略,模塊A、B和C分別代表脂肪酸、乙醇和生物柴油(FAEE)的合成途徑圖4 基于酯酰-CoA生物傳感器的動態(tài)調(diào)控策略Fig.4 Acyl-CoA biosensor based dynamic regulation strategies

3 胞外代謝物響應的動態(tài)調(diào)控策略

3.1 部分分泌型代謝物響應的動態(tài)調(diào)控策略

由于微生物膜系統(tǒng)的豐富載體和多種轉(zhuǎn)運模式并存，大多數(shù)代謝物都可部分穿透細胞膜而分泌到胞外或進入其他細胞。這種廣泛存在的細胞間物質(zhì)交換對單細胞動態(tài)調(diào)控的精準性造成了干擾。盡管如此，基于這種可部分跨膜轉(zhuǎn)運的代謝產(chǎn)物的動態(tài)調(diào)控策略依然備受關注，并且取得了良好的效果[32-34]。其中，基于氨基酸響應生物傳感器的動態(tài)調(diào)控在近年來的研究較為廣泛。TyrR是芳香族氨基酸合成途徑的調(diào)控蛋白，常常作為芳香族類化合物合成代謝網(wǎng)絡動態(tài)調(diào)控的中樞。其調(diào)控機制是當無苯丙氨酸或酪氨酸時TyrR形成2個二聚體結(jié)合于啟動子PtyrP或ParoF上游并激活下游基因表達；然而，當存在苯丙氨酸或酪氨酸時，TyrR與苯丙氨酸或酪氨酸形成TyrR-苯丙氨酸或TyrR-酪氨酸復合體，該復合體可相互結(jié)合形成六聚體并分別彎曲啟動子PtyrP或ParoF結(jié)構(gòu)，從而達到阻遏下游基因表達的效果[35]?；赥yrR的調(diào)控原理，CHOU等[35]設計了1個菌株表型進化的反饋調(diào)控系統(tǒng)(feedback-regulated e olution of phenotype,FREP)，該系統(tǒng)以TyrR傳感器為基礎調(diào)控大腸桿菌突變子(mutD5)表達水平，從而實現(xiàn)菌株快速進化的目標。具體而言，ParoF啟動子控制mutD5的表達，當菌株酪氨酸產(chǎn)量增加時會抑制mutD5的表達，進而降低突變發(fā)生的頻率；相反，當菌株酪氨酸產(chǎn)量較低時mutD5表達水平增加，進一步強化了該菌株的突變率，直至獲得高產(chǎn)酪氨酸菌株為止。此外，WU等[36]通過啟動子工程改造獲得了梯度強度PtyrP啟動子，該啟動子收到苯丙氨酸誘導。利用所構(gòu)建的PtyrP啟動子調(diào)控表達芳香族氨基酸合成途徑的關鍵酶——莽草酸激酶異構(gòu)酶(AroK)，成功構(gòu)建了可動態(tài)響應苯丙氨酸的動態(tài)調(diào)控菌株xllp3，獲得了61.3 g/L的苯丙氨酸，且產(chǎn)量和產(chǎn)率相比較未動態(tài)調(diào)控的菌株分別提高了1.36和1.22倍。

氨基酸可通過跨膜蛋白的主動運輸作用或自由擴散作用進出細胞，因此其在細胞內(nèi)外的濃度分布主要取決于濃度差以及轉(zhuǎn)運蛋白活性[37-38]。一般而言，當誘導物在胞內(nèi)的含量遠高于胞外含量時,不同單細胞之間的信號干擾較小。這是因為不同單細胞所分泌的誘導物難以通過自由擴散進入其他細胞，而經(jīng)過主動運輸進入后也會因為胞內(nèi)已存在的大量誘導物而降低了這種信號干擾的程度。因此，部分分泌型代謝物響應的動態(tài)調(diào)控根據(jù)胞內(nèi)外誘導物濃度差的不同將會產(chǎn)生不同的調(diào)控效果。

3.2 外排型代謝物響應的動態(tài)調(diào)控策略

有些代謝物主要通過自由運輸或主動運輸?shù)耐馀抛饔梅置诘郊毎?，因此會形成胞?nèi)代謝物含量等于或低于胞外代謝物含量的現(xiàn)象[39-40]。本文將這種代謝物定義為“外排型代謝物”。這種代謝物的動態(tài)調(diào)控策略往往無法進行精準的空間水平動態(tài)調(diào)控，因為胞外代謝物含量高于或等于胞內(nèi)，導致不同單細胞受到環(huán)境中代謝物的誘導作用相同，容易形成整個發(fā)酵系統(tǒng)所有單細胞的“集體調(diào)控”現(xiàn)象。微生物培養(yǎng)過程中的群體響應現(xiàn)象就是由該動態(tài)調(diào)控策略所控制的自然現(xiàn)象。據(jù)報道，細菌群體響應的信號分子N-高絲氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone,AHL)主要通過自由擴散和主動運輸作用進出細胞，細胞內(nèi)外的AHL含量基本相同[41-42]，這是群體響應的信號傳導基礎。群體響應分為2種調(diào)控模式，一種是來自Pantoeastewartia的EsaI-EsaR系統(tǒng)，該系統(tǒng)中EsaI催化合成AHL，AHL抑制EsaR對PesaS啟動子的激活作用；另一種是來自ibriofischeri的LuxI-LuxR系統(tǒng)，該系統(tǒng)中LuxI催化合成AHL，AHL與LuxR結(jié)合形成復合體進而激活PluxI下游基因的表達[17]。已有研究主要應用群體響應效應動態(tài)調(diào)控目標化合物合成途徑，從而達到平衡細胞生長和產(chǎn)物合成的目標[33]。具體而言，當菌體剛開始生長時菌體濃度較低，群體響應效應較弱，目標產(chǎn)物合成途徑關閉；當菌體濃度達到設定閾值后啟動群體響應效應，從而啟動目標產(chǎn)物合成[43-45]。近年來PRATHER課題組在群體響應的設計和應用中取得了較好成果[33,46-48]。例如，應用EsaI-EsaR系統(tǒng)調(diào)控柚皮素合成途徑(酪氨酸解氨酶和4-香豆酸:CoA連接酶)，同時LuxI-LuxR系統(tǒng)調(diào)控CRISPR/dCas抑制系統(tǒng)實現(xiàn)在生產(chǎn)階段抑制脂肪酸合成的目標(圖5)。最終DINH等[46]建立了一個群體響應的雙動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，顯著提高了柚皮素的生物合成效率，此外該系統(tǒng)對水楊酸的生物合成同樣具有顯著效果。

Module A-柚皮素合成模塊；Module B-丙二酰-CoA消耗抑制模塊圖5 基于群體響應效應的動態(tài)調(diào)控策略強化柚皮素合成Fig.5 Quorum sensing based dynamic regulation strategy to impro e the biosynthesis of naringenin

4 結(jié)論

目前存在多種時空水平的動態(tài)調(diào)控策略，且在發(fā)酵過程中展現(xiàn)出優(yōu)越的實時調(diào)控性能。將這些動態(tài)調(diào)控策略按照時空調(diào)控尺度不同分為環(huán)境響應型、胞內(nèi)代謝物響應型和胞外代謝物響應型動態(tài)調(diào)控策略。其中環(huán)境響應型動態(tài)調(diào)控策略主要以全體細胞的“集體調(diào)控”為主，在此基礎上實時監(jiān)測環(huán)境變化，并動態(tài)調(diào)節(jié)代謝途徑；胞內(nèi)代謝物響應型動態(tài)調(diào)控策略主要以單細胞的“個體調(diào)控”為主，在此基礎上實時監(jiān)測單細胞自身的生理生化環(huán)境變化，并動態(tài)調(diào)節(jié)代謝途徑；胞外代謝物響應型動態(tài)調(diào)控策略是一種處于“集體調(diào)控”與“個體調(diào)控”之間的過渡性策略，當胞內(nèi)代謝物含量遠高于胞外時則偏向于“個體調(diào)控”，當胞內(nèi)代謝物含量等于或低于胞外含量時則偏向于“集體調(diào)控”。這些動態(tài)調(diào)控策略各有優(yōu)缺點，胞內(nèi)代謝產(chǎn)物響應型動態(tài)調(diào)控策略雖然可以實現(xiàn)單細胞水平調(diào)控，但是由于僅有少數(shù)代謝物僅存在于胞內(nèi)，導致很多產(chǎn)物合成中無法應用此策略。因此，未來應用多種動態(tài)調(diào)控策略相結(jié)合的方式，構(gòu)建更加靈敏、適應復雜環(huán)境的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡將可能成為重要研究方向[46-51]。

此外，由于多數(shù)代謝物可分泌到胞外，并被其他細胞攝取，引起了不同單細胞之間的信號干擾。建立微觀尺度的單細胞發(fā)酵技術(shù)，實現(xiàn)單細胞的獨立發(fā)酵至關重要。作為一種可能的解決方案，結(jié)合微流控技術(shù)的微液滴發(fā)酵技術(shù)有效隔絕了單細胞之間的相互干擾，有望實現(xiàn)更加精準的發(fā)酵調(diào)控[52-53]。另一方面，雖然成千上萬的化合物實現(xiàn)了微生物法合成，但是其跨膜轉(zhuǎn)運模式以及胞內(nèi)外分布狀態(tài)依然報道較少，這不利于時空水平的動態(tài)調(diào)控研究。因此，未來通過蛋白質(zhì)工程手段調(diào)控代謝物在胞內(nèi)外的分布將有助于動態(tài)調(diào)控的精準控制，促進發(fā)酵工程合成更多高附加值化合物。