周勝虎，毛銀，鄧禹*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué),江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 無(wú)錫,214122)

近年來(lái)，隨著合成生物技術(shù)、代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)的快速發(fā)展與交叉融合，微生物發(fā)酵合成高附加值化學(xué)品得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步[1-2]。在此過(guò)程中，構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠始終是研究的核心。細(xì)胞工廠的傳統(tǒng)改造策略主要包括：過(guò)表達(dá)途徑基因、敲除或抑制產(chǎn)物降解途徑和競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑、蛋白質(zhì)工程改造限速酶和定向進(jìn)化強(qiáng)化菌株生產(chǎn)性能等[3-4]。這些改造策略的核心思想是最大化的引導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量流向產(chǎn)物合成方向，同時(shí)強(qiáng)化產(chǎn)物合成途徑的代謝通量。經(jīng)過(guò)上述改造策略已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多類重要化合物的高效合成，例如黃酮類化合物[5-6]、脂肪酸[7-8]、萜類化合物[9-11]、生物燃料[12-14]、聚合物單體化合物[15-16]等。然而，隨著底物消耗、副產(chǎn)物積累和產(chǎn)物合成，發(fā)酵過(guò)程中的環(huán)境始終處于不斷變化的過(guò)程中，這導(dǎo)致基因表達(dá)水平不能隨時(shí)與環(huán)境變化相適應(yīng)，因此僅僅通過(guò)簡(jiǎn)單的靜態(tài)代謝工程改造難以使細(xì)胞適應(yīng)復(fù)雜多變的發(fā)酵環(huán)境[17]。此外，發(fā)酵系統(tǒng)中每個(gè)單細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)都不相同，通過(guò)統(tǒng)一調(diào)節(jié)發(fā)酵條件(pH、溫度和碳源等)或者添加誘導(dǎo)劑(異丙基-β-D-硫代半糖苷等)的方式改變基因表達(dá)水平并不能使每一個(gè)細(xì)胞都處于最佳的生長(zhǎng)和生產(chǎn)狀態(tài)[18]。發(fā)酵系統(tǒng)中不同位置的細(xì)胞所處環(huán)境也不盡相同，這進(jìn)一步增加了調(diào)控的難度。因此，發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境變化具有瞬時(shí)的空間和時(shí)間特性。綜上，為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的高效合成，急需建立一種可在時(shí)間和空間水平上針對(duì)特定細(xì)胞所處的生理生化環(huán)境進(jìn)行精準(zhǔn)控制的調(diào)控手段。

為在發(fā)酵過(guò)程中實(shí)現(xiàn)時(shí)空水平的精準(zhǔn)調(diào)控，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了大量的生物傳感器用于實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化，同時(shí)根據(jù)監(jiān)測(cè)信號(hào)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)[19-20]。這些動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)的一般思路是以可響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化的生物傳感器控制關(guān)鍵基因，傳感器根據(jù)檢測(cè)到的信號(hào)變化強(qiáng)化或抑制基因表達(dá)，從而達(dá)到代謝流量調(diào)控的目標(biāo)[17-21]。

本文根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中代謝調(diào)控的時(shí)空尺度不同，將動(dòng)態(tài)調(diào)控策略分為環(huán)境響應(yīng)型、胞內(nèi)產(chǎn)物響應(yīng)型和胞外產(chǎn)物響應(yīng)型(圖1)。

a-發(fā)酵環(huán)境響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略；b-胞內(nèi)產(chǎn)物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略；c-胞外產(chǎn)物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略圖1 時(shí)空水平的動(dòng)態(tài)調(diào)控響應(yīng)機(jī)制Fig.1 The mechanisms of dynamic regulation in spatiotemporal le el

環(huán)境響應(yīng)型動(dòng)態(tài)調(diào)控針對(duì)整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)中所有細(xì)胞進(jìn)行集體調(diào)控(圖1-a)；胞內(nèi)產(chǎn)物響應(yīng)型動(dòng)態(tài)調(diào)控基于每個(gè)單細(xì)胞自身生理生化狀態(tài)而進(jìn)行自我調(diào)控(圖1-b)；胞外產(chǎn)物響應(yīng)型動(dòng)態(tài)調(diào)控的特點(diǎn)是代謝物可分泌出細(xì)胞并同時(shí)被其他單細(xì)胞攝取，這將會(huì)造成不同單細(xì)胞在空間尺度上的信號(hào)干擾(圖1-c)。

本文通過(guò)對(duì)比當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究，深入分析不同動(dòng)態(tài)調(diào)控策略的優(yōu)缺點(diǎn)，為更廣泛的代謝工程和發(fā)酵工程應(yīng)用提供理論參考。

1 發(fā)酵環(huán)境響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略

1.1 溫度響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略

溫度是發(fā)酵過(guò)程中的重要參數(shù)，不僅與能量消耗息息相關(guān)，同時(shí)也顯著影響著細(xì)胞生長(zhǎng)、酶的催化活性和產(chǎn)物的穩(wěn)定性。因此，通過(guò)溫度來(lái)調(diào)控微生物生長(zhǎng)與代謝是發(fā)酵過(guò)程控制的重要手段。對(duì)整個(gè)發(fā)酵體系進(jìn)行加熱或冷卻會(huì)影響體系中所有細(xì)胞的代謝過(guò)程，這種動(dòng)態(tài)調(diào)控策略忽略了微觀層面上每個(gè)單細(xì)胞的性能差異性，目標(biāo)是針對(duì)發(fā)酵體系中所有細(xì)胞集體的動(dòng)態(tài)調(diào)控。目前，應(yīng)用最為廣泛的溫敏型生物傳感器包括CI857阻遏蛋白介導(dǎo)的高溫激活傳感器以及CI434-te S阻遏蛋白突變體(TFts)介導(dǎo)的低溫激活傳感器[22-23]。其中CI857在溫度高于37 ℃時(shí)失去活性而無(wú)法與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而開(kāi)啟目標(biāo)基因表達(dá);當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)，CI857阻遏目標(biāo)基因表達(dá)。而TFts在溫度低于30 ℃時(shí)失去活性而無(wú)法與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而開(kāi)啟目標(biāo)基因表達(dá);當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，TFts阻遏目標(biāo)基因表達(dá)。基于這些調(diào)控機(jī)制，SUN等[24]構(gòu)建了一個(gè)乙醇生產(chǎn)菌株EscherichaicoliB0013-2021 HPA,該菌株的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程僅以木糖、半乳糖和阿拉伯糖為碳源，而乙醇合成過(guò)程僅以葡糖糖為碳源。在該工程菌株中，敲除了乙醇的競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑基因(pta-ackA、ldhA和pflB)，同時(shí)突變了葡萄糖的攝取和氧化的必需基因(glk、ptsG和manZ)。在此基礎(chǔ)上以受CI857調(diào)控的啟動(dòng)子pR/pL調(diào)控ptsG表達(dá)，從而達(dá)到葡萄糖消耗受溫度控制的目的。在低溫條件下大腸桿菌B0013-2021HPA利用木糖、半乳糖和阿拉伯糖生長(zhǎng)，隨后溫度升高到37 ℃后開(kāi)始利用葡萄糖合成乙醇。經(jīng)過(guò)12 h發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量比無(wú)動(dòng)態(tài)調(diào)控菌株提高1.4倍，達(dá)到4.06 g/(L·h)。與高溫激活的生物傳感器相比，低溫激活的生物傳感器鮮有報(bào)道和應(yīng)用。最近，ZHENG等[22]在低溫傳感器的設(shè)計(jì)和應(yīng)用上獲得了突破性進(jìn)展。在這項(xiàng)研究工作中，作者首先通過(guò)定向進(jìn)化獲得了受高溫激活的阻遏蛋白TFts、受低溫激活的蛋白酶TEts和MycoplasmaflorumLon蛋白酶(mf-Lon)。經(jīng)過(guò)巧妙組合，構(gòu)建了如圖2所示的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。在不同種大腸桿菌中,該系統(tǒng)均具有良好的功能，是目前已知低溫誘導(dǎo)生物傳感器中動(dòng)態(tài)范圍最廣、本地表達(dá)最低和對(duì)信號(hào)響應(yīng)速度最快的傳感器。此外，應(yīng)用該傳感器控制ftsZ和mreB的表達(dá)可實(shí)現(xiàn)大腸桿菌形態(tài)的動(dòng)態(tài)控制。

圖2 低溫誘導(dǎo)型生物傳感器工作機(jī)制Fig.2 The mechanisms of low temperature induced biosensor注:當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)TFts失去活性，無(wú)法阻遏TEts、TetR和目標(biāo)蛋白GOI的表達(dá)，此時(shí)TEts特異性的降解TFts蛋白從而進(jìn)一步強(qiáng)化GOI的表達(dá)。當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)TFts阻遏TEts、TetR和目標(biāo)蛋白GOI的表達(dá)，因此mf-Lon得以表達(dá)并特異性降解滲漏表達(dá)的GOI蛋白。鈍箭頭代表抑制作用。

1.2 pH響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略

綜上所述，無(wú)論是基于物理環(huán)境(如溫度)還是化學(xué)環(huán)境(如pH)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略都屬于針對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)全局的動(dòng)態(tài)調(diào)控。這些策略更加關(guān)注環(huán)境因素在時(shí)間水平上的波動(dòng)，而忽略了每個(gè)單細(xì)胞在空間水平上的不同需求。因?yàn)榘l(fā)酵系統(tǒng)是一個(gè)混合體系，在發(fā)酵過(guò)程中的任意時(shí)間段都存在著大量不同生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)胞、基因表達(dá)水平不同的細(xì)胞、代謝負(fù)擔(dān)不同的細(xì)胞和生產(chǎn)性能不同的細(xì)胞[18]，因此僅僅根據(jù)環(huán)境因素的時(shí)間水平對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)所有細(xì)胞進(jìn)行整體的動(dòng)態(tài)調(diào)控并不能滿足每個(gè)單細(xì)胞在空間水平上的需求。

圖3 基于TDAG8的pH響應(yīng)生物傳感器工作機(jī)制Fig.3 The mechanisms of TDAG8 dependent pH-responsi e biosensor

2 胞內(nèi)代謝物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略

為了同時(shí)滿足發(fā)酵系統(tǒng)中不同性能的單細(xì)胞在時(shí)間和空間水平上的不同需求，急需建立一種基于單細(xì)胞自身的獨(dú)特狀態(tài)進(jìn)行自我調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略。胞內(nèi)代謝物僅存在于細(xì)胞內(nèi)部，因此能體現(xiàn)每個(gè)單細(xì)胞獨(dú)特的生理狀態(tài)?；谶@些特性，胞內(nèi)代謝物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的時(shí)間和空間水平上的調(diào)控。

輔酶A(coenzyme A，CoA)及其硫酯化合物是胞內(nèi)典型的代謝中間產(chǎn)物，與胞內(nèi)能量供應(yīng)和物質(zhì)循環(huán)息息相關(guān)[1]。近年來(lái)，研究者們建立了多種基于胞內(nèi)丙二酰-CoA和酯酰-CoA含量變化的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略[28]。其中最為經(jīng)典的設(shè)計(jì)是XU等[29]的乙酰-CoA/丙二酰-CoA振蕩器和ZHANG等[30]的脂肪酸/酯酰-CoA動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。基于丙二酰-CoA的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略主要依賴于受丙二酰-CoA調(diào)控的阻遏蛋白FapR和1個(gè)17 bp長(zhǎng)度的結(jié)合位點(diǎn)fapO。當(dāng)胞內(nèi)丙二酰-CoA含量增加后可與FapR結(jié)合形成FapR-丙二酰-CoA復(fù)合體，該復(fù)合體無(wú)法識(shí)別fapO，從而無(wú)法形成阻遏作用，目標(biāo)蛋白得以表達(dá)[31]。相反，當(dāng)胞內(nèi)丙二酰-CoA不足時(shí)無(wú)法形成FapR-丙二酰-CoA復(fù)合體，F(xiàn)apR得以與fapO結(jié)合進(jìn)而阻遏目標(biāo)基因表達(dá)。為了構(gòu)建1個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控裝置用以實(shí)時(shí)平衡脂肪酸合成時(shí)乙酰-CoA和丙二酰-CoA含量，XU等[29]篩選得到了1個(gè)受FapR激活的啟動(dòng)子Pgap，將該啟動(dòng)子與受FapR阻遏的啟動(dòng)子T7-fapO結(jié)合，構(gòu)建得到了乙酰-CoA/丙二酰-CoA振蕩器(圖4-a)。當(dāng)胞內(nèi)丙二酰-CoA含量不足時(shí)該振蕩器激活Pgap表達(dá)并阻遏T7-fapO表達(dá)，從而分別強(qiáng)化乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丙二酰-CoA和抑制丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化為脂肪酸；當(dāng)胞內(nèi)丙二酰-CoA含量過(guò)高時(shí)該振蕩器阻遏Pgap表達(dá)并激活T7-fapO表達(dá)，從而分別抑制乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丙二酰-CoA和強(qiáng)化丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化為脂肪酸(圖4-b)。為了構(gòu)建1個(gè)平衡脂肪酸合成與酯酰-CoA積累的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，ZHANG等[30]首先設(shè)計(jì)了一個(gè)可高效響應(yīng)胞內(nèi)酯酰-CoA含量的生物傳感器(圖4-c)。該傳感器包括酯酰-CoA響應(yīng)的阻遏蛋白(FadR)和基于FadR結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建的啟動(dòng)子組成。當(dāng)胞內(nèi)酯酰-CoA不足時(shí)FadR與識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合并阻遏目標(biāo)基因表達(dá)；相反，當(dāng)胞內(nèi)酯酰-CoA含量過(guò)高時(shí)與FadR結(jié)合形成FadR-酯酰-CoA復(fù)合體，從而離開(kāi)結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)激活目標(biāo)基因表達(dá)。應(yīng)用該動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控丙酮酸脫羧酶(pdc)、醇脫氫酶(adhB)、酯酰-CoA合酶(fadD)和蠟酯合酶(atfA)的表達(dá)，最終獲得了1.5 g/L的生物柴油產(chǎn)量(圖4-c)。

總之，胞內(nèi)代謝產(chǎn)物響應(yīng)的生物傳感器由于可專一性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單細(xì)胞水平的代謝變化，為單細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)調(diào)控提供了新的思路。然而，在發(fā)酵過(guò)程中大多數(shù)代謝產(chǎn)物或中間產(chǎn)物往往可以不同程度地分泌到細(xì)胞外，這將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間的信號(hào)交叉，從而不同程度地影響在單細(xì)胞水平上生物傳感器對(duì)自身信號(hào)的監(jiān)測(cè)準(zhǔn)確度。

a-丙二酰-CoA振蕩器工作機(jī)制,箭頭和鈍箭頭分別代表激活和抑制作用;b-丙二酰-CoA振蕩器工作示意圖，當(dāng)丙二酰-CoA不足時(shí)啟動(dòng)ACC表達(dá)，當(dāng)丙二酰-CoA充足時(shí)啟動(dòng)FAS表達(dá);c-基于酯酰-CoA的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略,模塊A、B和C分別代表脂肪酸、乙醇和生物柴油(FAEE)的合成途徑圖4 基于酯酰-CoA生物傳感器的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略Fig.4 Acyl-CoA biosensor based dynamic regulation strategies

3 胞外代謝物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略

3.1 部分分泌型代謝物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略

由于微生物膜系統(tǒng)的豐富載體和多種轉(zhuǎn)運(yùn)模式并存，大多數(shù)代謝物都可部分穿透細(xì)胞膜而分泌到胞外或進(jìn)入其他細(xì)胞。這種廣泛存在的細(xì)胞間物質(zhì)交換對(duì)單細(xì)胞動(dòng)態(tài)調(diào)控的精準(zhǔn)性造成了干擾。盡管如此，基于這種可部分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略依然備受關(guān)注，并且取得了良好的效果[32-34]。其中，基于氨基酸響應(yīng)生物傳感器的動(dòng)態(tài)調(diào)控在近年來(lái)的研究較為廣泛。TyrR是芳香族氨基酸合成途徑的調(diào)控蛋白，常常作為芳香族類化合物合成代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)調(diào)控的中樞。其調(diào)控機(jī)制是當(dāng)無(wú)苯丙氨酸或酪氨酸時(shí)TyrR形成2個(gè)二聚體結(jié)合于啟動(dòng)子PtyrP或ParoF上游并激活下游基因表達(dá)；然而，當(dāng)存在苯丙氨酸或酪氨酸時(shí)，TyrR與苯丙氨酸或酪氨酸形成TyrR-苯丙氨酸或TyrR-酪氨酸復(fù)合體，該復(fù)合體可相互結(jié)合形成六聚體并分別彎曲啟動(dòng)子PtyrP或ParoF結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到阻遏下游基因表達(dá)的效果[35]。基于TyrR的調(diào)控原理，CHOU等[35]設(shè)計(jì)了1個(gè)菌株表型進(jìn)化的反饋調(diào)控系統(tǒng)(feedback-regulated e olution of phenotype,FREP)，該系統(tǒng)以TyrR傳感器為基礎(chǔ)調(diào)控大腸桿菌突變子(mutD5)表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)菌株快速進(jìn)化的目標(biāo)。具體而言，ParoF啟動(dòng)子控制mutD5的表達(dá)，當(dāng)菌株酪氨酸產(chǎn)量增加時(shí)會(huì)抑制mutD5的表達(dá)，進(jìn)而降低突變發(fā)生的頻率；相反，當(dāng)菌株酪氨酸產(chǎn)量較低時(shí)mutD5表達(dá)水平增加，進(jìn)一步強(qiáng)化了該菌株的突變率，直至獲得高產(chǎn)酪氨酸菌株為止。此外，WU等[36]通過(guò)啟動(dòng)子工程改造獲得了梯度強(qiáng)度PtyrP啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子收到苯丙氨酸誘導(dǎo)。利用所構(gòu)建的PtyrP啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)芳香族氨基酸合成途徑的關(guān)鍵酶——莽草酸激酶異構(gòu)酶(AroK)，成功構(gòu)建了可動(dòng)態(tài)響應(yīng)苯丙氨酸的動(dòng)態(tài)調(diào)控菌株xllp3，獲得了61.3 g/L的苯丙氨酸，且產(chǎn)量和產(chǎn)率相比較未動(dòng)態(tài)調(diào)控的菌株分別提高了1.36和1.22倍。

氨基酸可通過(guò)跨膜蛋白的主動(dòng)運(yùn)輸作用或自由擴(kuò)散作用進(jìn)出細(xì)胞，因此其在細(xì)胞內(nèi)外的濃度分布主要取決于濃度差以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性[37-38]。一般而言，當(dāng)誘導(dǎo)物在胞內(nèi)的含量遠(yuǎn)高于胞外含量時(shí),不同單細(xì)胞之間的信號(hào)干擾較小。這是因?yàn)椴煌瑔渭?xì)胞所分泌的誘導(dǎo)物難以通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入其他細(xì)胞，而經(jīng)過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入后也會(huì)因?yàn)榘麅?nèi)已存在的大量誘導(dǎo)物而降低了這種信號(hào)干擾的程度。因此，部分分泌型代謝物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控根據(jù)胞內(nèi)外誘導(dǎo)物濃度差的不同將會(huì)產(chǎn)生不同的調(diào)控效果。

3.2 外排型代謝物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略

有些代謝物主要通過(guò)自由運(yùn)輸或主動(dòng)運(yùn)輸?shù)耐馀抛饔梅置诘郊?xì)胞外，因此會(huì)形成胞內(nèi)代謝物含量等于或低于胞外代謝物含量的現(xiàn)象[39-40]。本文將這種代謝物定義為“外排型代謝物”。這種代謝物的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略往往無(wú)法進(jìn)行精準(zhǔn)的空間水平動(dòng)態(tài)調(diào)控，因?yàn)榘獯x物含量高于或等于胞內(nèi)，導(dǎo)致不同單細(xì)胞受到環(huán)境中代謝物的誘導(dǎo)作用相同，容易形成整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)所有單細(xì)胞的“集體調(diào)控”現(xiàn)象。微生物培養(yǎng)過(guò)程中的群體響應(yīng)現(xiàn)象就是由該動(dòng)態(tài)調(diào)控策略所控制的自然現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌群體響應(yīng)的信號(hào)分子N-高絲氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone,AHL)主要通過(guò)自由擴(kuò)散和主動(dòng)運(yùn)輸作用進(jìn)出細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)外的AHL含量基本相同[41-42]，這是群體響應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)基礎(chǔ)。群體響應(yīng)分為2種調(diào)控模式，一種是來(lái)自Pantoeastewartia的EsaI-EsaR系統(tǒng)，該系統(tǒng)中EsaI催化合成AHL，AHL抑制EsaR對(duì)PesaS啟動(dòng)子的激活作用；另一種是來(lái)自ibriofischeri的LuxI-LuxR系統(tǒng)，該系統(tǒng)中LuxI催化合成AHL，AHL與LuxR結(jié)合形成復(fù)合體進(jìn)而激活PluxI下游基因的表達(dá)[17]。已有研究主要應(yīng)用群體響應(yīng)效應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控目標(biāo)化合物合成途徑，從而達(dá)到平衡細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的目標(biāo)[33]。具體而言，當(dāng)菌體剛開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)菌體濃度較低，群體響應(yīng)效應(yīng)較弱，目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑關(guān)閉；當(dāng)菌體濃度達(dá)到設(shè)定閾值后啟動(dòng)群體響應(yīng)效應(yīng)，從而啟動(dòng)目標(biāo)產(chǎn)物合成[43-45]。近年來(lái)PRATHER課題組在群體響應(yīng)的設(shè)計(jì)和應(yīng)用中取得了較好成果[33,46-48]。例如，應(yīng)用EsaI-EsaR系統(tǒng)調(diào)控柚皮素合成途徑(酪氨酸解氨酶和4-香豆酸:CoA連接酶)，同時(shí)LuxI-LuxR系統(tǒng)調(diào)控CRISPR/dCas抑制系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)在生產(chǎn)階段抑制脂肪酸合成的目標(biāo)(圖5)。最終DINH等[46]建立了一個(gè)群體響應(yīng)的雙動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，顯著提高了柚皮素的生物合成效率，此外該系統(tǒng)對(duì)水楊酸的生物合成同樣具有顯著效果。

Module A-柚皮素合成模塊；Module B-丙二酰-CoA消耗抑制模塊圖5 基于群體響應(yīng)效應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略強(qiáng)化柚皮素合成Fig.5 Quorum sensing based dynamic regulation strategy to impro e the biosynthesis of naringenin

4 結(jié)論

目前存在多種時(shí)空水平的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略，且在發(fā)酵過(guò)程中展現(xiàn)出優(yōu)越的實(shí)時(shí)調(diào)控性能。將這些動(dòng)態(tài)調(diào)控策略按照時(shí)空調(diào)控尺度不同分為環(huán)境響應(yīng)型、胞內(nèi)代謝物響應(yīng)型和胞外代謝物響應(yīng)型動(dòng)態(tài)調(diào)控策略。其中環(huán)境響應(yīng)型動(dòng)態(tài)調(diào)控策略主要以全體細(xì)胞的“集體調(diào)控”為主，在此基礎(chǔ)上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)環(huán)境變化，并動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)代謝途徑；胞內(nèi)代謝物響應(yīng)型動(dòng)態(tài)調(diào)控策略主要以單細(xì)胞的“個(gè)體調(diào)控”為主，在此基礎(chǔ)上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單細(xì)胞自身的生理生化環(huán)境變化，并動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)代謝途徑；胞外代謝物響應(yīng)型動(dòng)態(tài)調(diào)控策略是一種處于“集體調(diào)控”與“個(gè)體調(diào)控”之間的過(guò)渡性策略，當(dāng)胞內(nèi)代謝物含量遠(yuǎn)高于胞外時(shí)則偏向于“個(gè)體調(diào)控”，當(dāng)胞內(nèi)代謝物含量等于或低于胞外含量時(shí)則偏向于“集體調(diào)控”。這些動(dòng)態(tài)調(diào)控策略各有優(yōu)缺點(diǎn)，胞內(nèi)代謝產(chǎn)物響應(yīng)型動(dòng)態(tài)調(diào)控策略雖然可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平調(diào)控，但是由于僅有少數(shù)代謝物僅存在于胞內(nèi)，導(dǎo)致很多產(chǎn)物合成中無(wú)法應(yīng)用此策略。因此，未來(lái)應(yīng)用多種動(dòng)態(tài)調(diào)控策略相結(jié)合的方式，構(gòu)建更加靈敏、適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將可能成為重要研究方向[46-51]。

此外，由于多數(shù)代謝物可分泌到胞外，并被其他細(xì)胞攝取，引起了不同單細(xì)胞之間的信號(hào)干擾。建立微觀尺度的單細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的獨(dú)立發(fā)酵至關(guān)重要。作為一種可能的解決方案，結(jié)合微流控技術(shù)的微液滴發(fā)酵技術(shù)有效隔絕了單細(xì)胞之間的相互干擾，有望實(shí)現(xiàn)更加精準(zhǔn)的發(fā)酵調(diào)控[52-53]。另一方面，雖然成千上萬(wàn)的化合物實(shí)現(xiàn)了微生物法合成，但是其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模式以及胞內(nèi)外分布狀態(tài)依然報(bào)道較少，這不利于時(shí)空水平的動(dòng)態(tài)調(diào)控研究。因此，未來(lái)通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段調(diào)控代謝物在胞內(nèi)外的分布將有助于動(dòng)態(tài)調(diào)控的精準(zhǔn)控制，促進(jìn)發(fā)酵工程合成更多高附加值化合物。