張 旭，唐瞻楊,2，黃 凱，王麗群，宿志健，劉 婷，王婧杰，麻艷群

( 1.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004； 2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021 )

維生素是機(jī)體生命活動(dòng)中必需的一種微量化合物，對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)、繁育等具有促進(jìn)作用[1]。作為維生素家族的一員，維生素E俗稱生育酚，可促進(jìn)魚類生長(zhǎng)、提高免疫力、增強(qiáng)抗氧化性、提高生產(chǎn)性能等，在魚類生命活動(dòng)中起重要作用[2]。維生素E是魚類機(jī)體不可或缺的物質(zhì)且自身無法合成需在食物中攝入，飼料中維生素E含量將影響魚類體內(nèi)維生素E水平，長(zhǎng)時(shí)間缺乏維生素E將會(huì)給魚類帶來不良影響[3]。維生素E在水生生物應(yīng)用方面的研究報(bào)道已有很多，如細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)[4]幼魚和胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)[5]幼魚飼料中維生素E需求量的研究顯示，飼料中添加適量維生素E可以顯著提高細(xì)鱗鮭幼魚和胭脂魚幼魚的生長(zhǎng)指數(shù)；在飼料中添加90 mg/kg劑量的維生素E可以顯著促進(jìn)吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)[2]的生長(zhǎng)；缺乏維生素E鯉魚(Cyprinuscarpio)[6]性腺的發(fā)育指數(shù)明顯降低；飼料中添加600 mg/kg維生素E可顯著提高金鯽(Carassiusauratusred)[7]性腺發(fā)育指數(shù)；

飼料中添加維生素E促進(jìn)了吉富羅非魚[8]的生殖和免疫功能。

羅非魚作為動(dòng)物蛋白的主要來源在我國漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮了重要的作用[9]。維生素E對(duì)尼羅羅非魚(O.niloticus)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及性腺發(fā)育組織學(xué)影響等方面尚缺乏研究。組織切片可用于觀察細(xì)胞形態(tài)、判斷組織發(fā)育狀況等，是反映組織形態(tài)變化的最有效方法[10-11]。樊佳偉等[12]對(duì)斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides，♀)×鞍帶石斑魚(E.lanceolatus，♂)的受精細(xì)胞組織切片進(jìn)行了觀察。隨著組織切片技術(shù)的不斷優(yōu)化，其在斑馬魚(Daniorerio)[13]、吉富羅非魚[14]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[15]等水生生物中已得到廣泛應(yīng)用。筆者對(duì)不同維生素E水平下雌、雄尼羅羅非魚腸道和性腺石蠟組織切片進(jìn)行分析，擬從組織學(xué)角度探討維生素E對(duì)尼羅羅非魚腸道及性腺發(fā)育產(chǎn)生的影響。試驗(yàn)結(jié)果將為尼羅羅非魚組織學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)，亦為今后尼羅羅非魚產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)魚來源于廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，分別挑選健康、有活力的雌性尼羅羅非魚和雄性尼羅羅非魚作為試驗(yàn)對(duì)象，試驗(yàn)開始前在溫度(28.0±0.5) ℃、pH 8.0的環(huán)境中暫養(yǎng)10 d，暫養(yǎng)期間正常投食。

1.1.2 試劑

無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水和中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，蘇木素—伊紅染液(武漢谷歌生物科技)，4%多聚甲醛通用型組織固定液(廣西南寧楚杰生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器

脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司JJ-12J)、包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司JB-P5)、切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司RM2016)、烘箱(上?；厶﹥x器制造有限公司DHG-9140A)、正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康Nikon Eclipse CI)。

1.2 飼料制備

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料由百洋產(chǎn)業(yè)投資集團(tuán)股份有限公司提供，原料組成包括：玉米、次粉、魚粉、豆粕、菜粕、磷酸二氫鈣、氯化鈉等。維生素E(98%)由源葉生物提供，以30 mL/kg大豆油為溶劑。基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量維生素E制備5種試驗(yàn)飼料，分別為0 mg/kg組、40 mg/kg組、80 mg/kg組、120 mg/kg組和160 mg/kg組，飼料混合均勻后密封于低溫干燥處保存?zhèn)溆?，試?yàn)飼料營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

養(yǎng)殖試驗(yàn)時(shí)間為2019年7月15日—8月14

表1 飼料的組成與營養(yǎng)水平 %Tab.1 The ingredients and nutritional levels of the diet

日，為期30 d。試驗(yàn)共設(shè)10個(gè)組別，分別為：雌性尼羅羅非魚對(duì)照組(0 mg/kg組)，雌性尼羅羅非魚試驗(yàn)組(40 mg/kg組、80 mg/kg組、120 mg/kg組和160 mg/kg組)；雄性尼羅羅非魚對(duì)照組(0 mg/kg組)，雄性尼羅羅非魚試驗(yàn)組(40 mg/kg組、80 mg/kg組、120 mg/kg組和160 mg/kg組)。每個(gè)試驗(yàn)組3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾試驗(yàn)魚，養(yǎng)殖期間保持養(yǎng)殖環(huán)境不變，同一編號(hào)雌性、雄性尼羅羅非魚投喂相同飼料。試驗(yàn)雌性尼羅羅非魚初始體質(zhì)量為(19.81±3.90) g，初始全長(zhǎng)為(9.73±0.66) cm，試驗(yàn)雄性尼羅羅非魚初始體質(zhì)量為(18.55±3.65) g，初始全長(zhǎng)為(9.75±0.71) cm。養(yǎng)殖用水為曝曬除氯自來水，換水1次/3 d。每日9:00和17:00各飽食投喂1次，飼料以1 h內(nèi)吃完為基準(zhǔn)，養(yǎng)殖期間試驗(yàn)魚狀況良好均未出現(xiàn)染病及死亡現(xiàn)象。

1.4 生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，分別測(cè)量雌、雄尼羅羅非魚全長(zhǎng)、體質(zhì)量，計(jì)算生長(zhǎng)參數(shù)：

特定生長(zhǎng)率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

質(zhì)量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

相對(duì)增長(zhǎng)率/%=(L2-L1)/L1×100%

式中，m1為試驗(yàn)魚初始體質(zhì)量(g)，m2為試驗(yàn)魚終末體質(zhì)量(g)，L1為試驗(yàn)魚初始全長(zhǎng)(cm)，L2為試驗(yàn)魚終末全長(zhǎng)(cm)，t為養(yǎng)殖時(shí)間(d)。

1.5 腸道及性腺組織分析

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在雌性、雄性每組試驗(yàn)魚中分別隨機(jī)選取3尾，用魚安定麻醉處理后立即在冰盤上解剖采集中腸和性腺組織，隨即浸泡于4%多聚甲醛通用型組織固定液進(jìn)行固定。

石蠟組織切片制作方法如下：

脫水機(jī)脫水、浸蠟過程：75%酒精4 h→85%酒精2 h→90%酒精2 h→95%酒精1 h→無水乙醇Ⅰ 30 min→無水乙醇Ⅱ 30 min→醇苯5～10 min→二甲苯Ⅰ 5～10 min→二甲苯Ⅱ 5～10 min→蠟Ⅰ 1 h→蠟Ⅱ 1 h→蠟Ⅲ 1 h。包埋機(jī)、切片機(jī)分別進(jìn)行包埋和切片處理，片厚4 μm，60 ℃烘箱烤片。

脫蠟程序：二甲苯Ⅰ 20 min→二甲苯Ⅱ 20 min→無水乙醇Ⅰ 10 min→無水乙醇Ⅱ 10 min→95%酒精5 min→90%酒精5 min→80%酒精5 min→70%酒精5 min→蒸餾水洗。

蘇木精—伊紅染色過程：蘇木精染3～8 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗，伊紅染液染色1～3 min。

脫水封片過程：95%酒精Ⅰ 5 min→95%酒精Ⅱ 5 min→無水乙醇Ⅰ 5 min→無水乙醇Ⅱ 5 min→二甲苯Ⅰ 5 min→二甲苯Ⅱ 5 min中脫水透明處理，切片從二甲苯取出稍晾干，中性樹膠封片。

使用正置光學(xué)顯微鏡對(duì)每張性腺和腸道組織切片進(jìn)行拍照，在每張腸道切片中隨機(jī)選取3根完整絨毛應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分別測(cè)量絨毛高度(mm)、肌層厚度(mm)、絨毛中間區(qū)域?qū)挾?mm)并求平均值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 利用Duncan′s 功能進(jìn)行多重比較分析, 差異顯著水平為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)參數(shù)

尼羅羅非魚生長(zhǎng)參數(shù)見表2。飼料中添加維生素E對(duì)雌性尼羅羅非魚終末體質(zhì)量、終末全長(zhǎng)、質(zhì)量增加率、相對(duì)增長(zhǎng)率和特定生長(zhǎng)率均起到促進(jìn)作用，其中添加量為120 mg/kg時(shí)作用效果最佳(P<0.05)。維生素E添加量為160 mg/kg時(shí)雄性尼羅羅非魚終末體質(zhì)量、質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率達(dá)到最大值(P<0.05)。飼料中添加維生素E對(duì)雄性尼羅羅非魚終末全長(zhǎng)和相對(duì)增長(zhǎng)率無顯著影響(P>0.05)。以飼料中維生素E添加量為自變量，雌、雄尼羅羅非魚質(zhì)量增加率為因變量，分別將雌、雄尼羅羅非魚質(zhì)量增加率(y)與維生素E添加量(x)進(jìn)行回歸分析，回歸方程如下：

雌性：y=-8×10-5x2+0.0173x+0.8434 (r2=0.9875)

雄性：y=0.0051x+1.9059 (r2=0.9225)

經(jīng)回歸分析發(fā)現(xiàn)，雌性、雄性尼羅羅非魚體質(zhì)量增加率與維生素E添加量的回歸曲線擬合優(yōu)度r2分別為0.9875和0.9225，說明回歸曲線對(duì)觀測(cè)值的擬合程度較好滿足試驗(yàn)分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，雌性尼羅羅非魚質(zhì)量增加率在維生素E添加量為120 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值，雄性尼羅羅非魚質(zhì)量增加率在維生素E添加量為160 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值。

2.2 腸絨毛參數(shù)

尼羅羅非魚雌魚、雄魚中腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)見圖1。對(duì)每張切片絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，飼料中維生素E添加量為80 mg/kg時(shí)，雌性尼羅羅非魚肌層厚度最大(P<0.05)(表3)；維生素E添加量為120 mg/kg時(shí)，雌性尼羅羅非魚絨毛寬度顯著升高(P<0.05)。飼料中添加維生素E對(duì)雄性尼羅羅非魚中腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著影響(P>0.05)。

表2 雌性、雄性尼羅羅非魚的性狀參數(shù)Tab.2 Growth parameters of male and female Nile tilapia O. niloticus

表3 腸道形態(tài)學(xué)參數(shù) mmTab.3 Intestinal morphological parameters

2.3 性腺發(fā)育指數(shù)

尼羅羅非魚卵巢、精巢組織發(fā)育情況見圖2，參照文獻(xiàn)[16]的性腺分期方法對(duì)尼羅羅非魚性腺發(fā)育情況進(jìn)行分析。尼羅羅非魚卵巢發(fā)育情況：0 mg/kg(♀)組卵巢組織細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)呈嗜堿性被染成深藍(lán)色，細(xì)胞核呈嗜酸性被染成紅色，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)核仁，屬Ⅱ期卵巢(圖2a)。40 mg/kg(♀)組、80 mg/kg(♀)組和160 mg/kg(♀)組卵巢組織細(xì)胞形態(tài)規(guī)則多為圓形，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核顏色減弱，胞內(nèi)出現(xiàn)不規(guī)則空泡，核仁緊貼核膜排布，屬Ⅲ期卵巢(圖2b,c,e)。120 mg/kg(♀)組卵巢組織細(xì)胞變大，核膜開始溶解，核仁消失，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿大的卵黃顆粒與空泡交錯(cuò)排列，屬Ⅴ期卵巢(圖2d)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，維生素E含量為120 mg/kg時(shí)尼羅羅非魚卵巢發(fā)育程度最好，屬Ⅴ期卵巢。

尼羅羅非魚精巢發(fā)育情況：0 mg/kg(♂)組和40 mg/kg(♂)組精巢組織中初級(jí)精母細(xì)胞較多且細(xì)胞較小，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則多為圓形，細(xì)胞核染色較深，屬Ⅱ期精巢(圖2f,g)。80 mg/kg(♂)組和120 mg/kg(♂)組精巢組織中次級(jí)精母細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞并存，細(xì)胞核嗜堿性染色較深，屬Ⅲ期精巢(圖2h,i)。160 mg/kg(♂)組精巢組織中發(fā)現(xiàn)精小管含有大量精子細(xì)胞以及少數(shù)成熟精子，精子細(xì)胞沒有明顯核質(zhì)界限，染色較深，屬Ⅳ期精巢(圖2j)。在維生素E添加量為160 mg/kg時(shí)尼羅羅非魚精巢發(fā)育程度最高，屬Ⅳ期精巢。

圖2 尼羅羅非魚性腺組織(♀：卵巢； ♂：精巢)切片F(xiàn)ig.2 The gonad histological section of Nile tilapia O. niloticus (♀：ovary； ♂：testis)N.細(xì)胞核； Nu.核仁； PS.初級(jí)精母細(xì)胞； Sp.精子； St.精子細(xì)胞； YV.卵黃泡； ZR.放射帶.N.nucleus; Nu.nucleolus; PS.primary spermatocyte; Sp.sperm; St.spermatid; YV.yolk vesicle; ZR.zona radiata.

3 討 論

3.1 維生素E對(duì)尼羅羅非魚生長(zhǎng)性能的影響

大量研究結(jié)果表明，維生素E是魚類維持正常生命活動(dòng)的必需物質(zhì)，缺乏維生素E會(huì)引起魚體各項(xiàng)機(jī)能發(fā)生紊亂，不利于魚類的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。王源等[17]研究表明，在飼料中添加30 mg/kg維生素E可顯著促進(jìn)三文魚生長(zhǎng)發(fā)育；劉漢鵬[18]研究表明，在七彩神仙魚(Symphysodonharaldi)幼魚飼料中添加80 mg/kg維生素E可顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。常杰等[4,19]研究表明，適量維生素E可改善細(xì)鱗鮭幼魚和瑪拉巴石斑魚(E.malabaricus)的生長(zhǎng)性能；張志強(qiáng)等[5]在胭脂魚幼魚對(duì)維生素E需求量的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中維生素E添加量為50.60 mg/kg時(shí)獲得最大生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中維生素E添加量為120 mg/kg時(shí)雌性尼羅羅非魚生長(zhǎng)性能最佳，雄性尼羅羅非魚在維生素E添加量為160 mg/kg時(shí)生長(zhǎng)性能最佳，飼料中添加適量維生素E可顯著提高尼羅羅非魚生長(zhǎng)性能，這與上述研究結(jié)果相符。此外，物種不同或相同物種生長(zhǎng)階段不同都會(huì)造成對(duì)維生素E的需求量不同[20-22]，推測(cè)尼羅羅非魚雌魚與雄魚由于所處生長(zhǎng)發(fā)育階段不同造成了維生素E最適添加量的差異。

3.2 維生素E對(duì)尼羅羅非魚消化道結(jié)構(gòu)的影響

腸道是魚類進(jìn)食后消化吸收的重要器官，其絨毛形態(tài)和肌層厚度將影響魚類的消化吸收能力[23-24]。腸絨毛作為腸道內(nèi)部消化吸收的主要部位，其長(zhǎng)度和寬度影響腸道內(nèi)部消化吸收的表面積，面積越大則腸道消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的效率越高；肌層厚度影響腸道肌肉蠕動(dòng)能力，能力越強(qiáng)越有利于腸道內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸和吸收[25]。王壇等[26]研究發(fā)現(xiàn)，飼用溶菌酶可以顯著促進(jìn)吉富羅非魚腸道絨毛高度，對(duì)吉富羅非魚的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用；胡海濱等[27]在大豆黃酮對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)生長(zhǎng)、消化酶活力、抗氧化力及腸道結(jié)構(gòu)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，適量的大豆黃酮可以改善大菱鲆后腸腸道結(jié)構(gòu),保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)完整性。本試驗(yàn)中，維生素E添加量為80 mg/kg時(shí)雌性尼羅羅非魚肌層厚度顯著升高，維生素E添加量為120 mg/kg時(shí)雌性尼羅羅非魚絨毛寬度顯著升高，同樣維生素E添加量條件下雌性尼羅羅非魚生長(zhǎng)均受到顯著促進(jìn)作用，由此可知，飼料中添加維生素E可以通過改善雌性尼羅羅非魚腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高腸道消化吸收能力進(jìn)而促進(jìn)雌性尼羅羅非魚的生長(zhǎng)發(fā)育。但本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼料中添加維生素E對(duì)雄性尼羅羅非魚腸道組織結(jié)構(gòu)影響不顯著，推測(cè)試驗(yàn)魚性別不同造成了維生素E需求量的不同，雄性尼羅羅非魚對(duì)維生素E需求量的研究還有待進(jìn)一步深入。綜上所述，飼料中添加適量維生素E可改善雌性尼羅羅非魚絨毛形態(tài)和肌層厚度，提高雌性尼羅羅非魚的消化吸收能力，促進(jìn)雌性尼羅羅非魚的生長(zhǎng)。

3.3 維生素E對(duì)尼羅羅非魚繁殖性能的影響

維生素E作為一類酚類化合物與機(jī)體固醇類激素合成密切相關(guān)，其在促進(jìn)水生動(dòng)物性腺發(fā)育提高繁殖性能等方面具有重要的作用[28]。大量研究表明，維生素E對(duì)半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[29]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[30]、鯉魚[6]、金鯽[7]等水生動(dòng)物的繁殖性能均有顯著促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，維生素E對(duì)尼羅羅非魚卵巢、精巢發(fā)育均起到促進(jìn)作用，其中，維生素E添加量為120 mg/kg時(shí)，尼羅羅非魚卵巢發(fā)育成熟度最好，維生素E添加量為160 mg/kg時(shí)，尼羅羅非魚精巢發(fā)育成熟度最好，這與上述研究結(jié)果相符。

4 結(jié) 論

維生素E作為一種重要的微量營養(yǎng)因子和天然的抗氧化劑，是存在于所有細(xì)胞膜和細(xì)胞器中的高效生物抗氧化劑，與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。飼料中添加適量維生素E不但可以有效調(diào)控性腺中類固醇激素的生物合成，促進(jìn)機(jī)體性腺發(fā)育提高動(dòng)物的繁殖性能，而且也可以調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體新陳代謝促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)。