李成偉，王 均，劉嘉惠，耿 毅

( 1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.內(nèi)江師范學(xué)院，四川 內(nèi)江 641100；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130 )

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象

1.2 病原菌的分離與鏡檢

1.3 人工感染試驗(yàn)

1.4 分離菌株理化特性及藥敏試驗(yàn)

將純化后的分離菌株接種于微量生化管中，28 ℃下培養(yǎng)24 h，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化特性鑒定。采用藥敏紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，試驗(yàn)藥物包括：卡那霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、多黏菌素B、阿奇霉素等27種藥物。

1.5 16S rRNA和gyrB基因擴(kuò)增及序列測(cè)定

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA作為PCR模板。采用細(xì)菌16S rRNA和gyrB基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

將分離菌株的16S rRNA基因序列和gyrB基因擴(kuò)增序列于GenBank中已知核酸序列進(jìn)行Blastn分析，調(diào)出與該序列相關(guān)性較高的核酸序列，用MEGA 6.0軟件包中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，重復(fù)抽樣1000次分析系統(tǒng)樹(shù)各分枝的置信度。

1.6 病理組織學(xué)觀察

2 結(jié) 果

2.1 病魚(yú)臨床癥狀

病魚(yú)頭部、鰭條基部、眼球嚴(yán)重出血，泄殖孔紅腫，鰓絲腫脹、充血，剖解后各內(nèi)臟器官?gòu)V泛性出血：脂肪、肝臟、脾臟、腎臟、魚(yú)鰾、腸道嚴(yán)重出血，肝臟腫大，腸道內(nèi)有血樣黏液，內(nèi)有少量或無(wú)食物，個(gè)別病魚(yú)帶有血樣腹水(圖1)。

2.2 病原菌的分離與鏡檢

病魚(yú)經(jīng)采血制作血涂片，鰓絲、體表黏液和腸道內(nèi)容物壓片后，在顯微鏡下觀察，未見(jiàn)寄生蟲(chóng)。在28 ℃培養(yǎng)24 h后，從病魚(yú)的肝臟、腎臟中分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌，表現(xiàn)為邊緣齊整、圓形光滑、中間較凸起、淡黃色的菌落，革蘭氏染色顯示為陰性、兩端鈍圓無(wú)芽孢的短桿菌，將該菌株編號(hào)為CW。

圖1 自然發(fā)病魚(yú)癥狀Fig.1 Symptoms of naturally diseased channel catfish I. punctatusa.頭部、眼球、鰭條基部充血； b.腹腔內(nèi)廣泛性出血.a.congestion of head, eyeball and fin base; b.extensive hemorrage of viscera.

2.3 人工感染試驗(yàn)

表1 菌株CW人工感染試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Artificial infection results of the strain CW

2.4 理化特性結(jié)果

生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株CW能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖，但纖維二糖、阿拉伯糖、乳糖、尿素酶呈陰性；賴(lài)氨酸、吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，各項(xiàng)生理生化指標(biāo)與《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中所列的嗜水氣單胞菌基本相符。

2.5 16S rRNA和gyrB基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

以分離菌株CW的DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA和gyrB基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)和凝膠成像系統(tǒng)后，16S rRNA基因約于1500 bp得到其目的條帶，gyrB基因約于1300 bp得到其目的條帶(圖2)。經(jīng)測(cè)序得到16S rRNA序列1423 bp(GenBank登錄號(hào)：MN475912)，gyrB基因1143 bp(GenBank登錄號(hào)：MN504786)。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，在16S rRNA序列、gyrB序列上，菌株CW均分別聚在嗜水氣單胞菌的分支上(圖3、圖4)。結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，判定菌株CW為嗜水氣單胞菌。

圖2 菌株CW的16S rRNA和gyrB基因檢測(cè)Fig.2 PCR products of 16S rRNA and gyrB gene of the strain CWM.Marker D2000； 1.16S rRNA； 2.gyrB.

圖3 菌株CW的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the strain CW based on 16s rRNA

圖4 菌株CW的gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the strain CW based on gyrB sequences

2.6 藥物敏感性試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示(表2)，嗜水氣單胞菌CW對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、吡哌酸、妥布霉素敏感(S)，對(duì)卡那霉素、多黏菌素B、阿奇霉素中度敏感(I)，對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、多西環(huán)素等20種抗生素耐藥(R)。

表2 嗜水氣單胞菌CW藥物敏感試驗(yàn)Tab.2 Antibiotic susceptibility test of the strain CW

2.7 病理組織學(xué)觀察

病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，肝小葉中央靜脈淤血(圖5a)，肝血竇受壓，體積縮小，狄氏間隙明顯增寬(圖5b)，肝細(xì)胞腫脹，廣泛性顆粒變性、空泡變性，局灶性肝細(xì)胞溶解，結(jié)構(gòu)均質(zhì)化，部分肝小葉出現(xiàn)壞死灶(圖5c)；腎小管上皮廣泛性顆粒與空泡變性，其間發(fā)生壞死、脫落，整個(gè)腎小管結(jié)構(gòu)壞死(圖5d)，腎間質(zhì)淤血、出血，組織增生，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5e)；脾臟廣泛性淤血，其間有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5f)，淋巴細(xì)胞壞死，數(shù)量減少，淤血、出血，大量含鐵血黃素沉積(圖5g)；腸黏膜上皮細(xì)胞腫脹，局灶性區(qū)域壞死脫落(圖5h)，固有膜與黏膜下層疏松、水腫，有大量嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5i)；鰓小葉細(xì)胞腫脹，局部增生，局部區(qū)域鰓小葉上皮壞死脫落，血管裸露，甚至整個(gè)小葉壞死溶解、結(jié)構(gòu)消失，并有大量嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5j)；心肌纖維腫脹，橫紋消失，顆粒變性、空泡變性，局部肌纖維壞死、斷裂或溶解，并有大量淋巴細(xì)胞與噬中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5k)；眼球脈絡(luò)膜充血、出血(圖5l)。

圖5 感染嗜水氣單胞菌病斑點(diǎn)叉尾的組織病理?yè)p傷Fig.5 The pathohistological observation of channel catfish I. punctatus infected by A. hydrophilaa.肝小葉中央靜脈淤血(→)； b.狄氏間隙增寬(→)； c.肝細(xì)胞腫脹(→)，廣泛顆粒變性、空泡變性(▲)； d.腎小管壞死溶解(→)，腎間質(zhì)淤血、出血(▲)； e.淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(→)； f.脾臟廣泛性淤血(→)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(▲)； g.淋巴細(xì)胞壞死，數(shù)量減少(→)，含鐵血黃素沉積(▲)； h.腸黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落(→)； i.腸黏膜下層嗜酸性細(xì)胞(→)、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(▲)； j.鰓小葉上皮細(xì)胞脫落(→)，嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)(▲)； k.心肌中性粒細(xì)胞(→)、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(▲)； l.眼球脈絡(luò)膜充血、出血(→).a.congestion of central vein of hepatic lobule(→)； b.widening and congestion of the Dickel space(→)； c.hepatocellular swelling(→)，denaturation of granules and vacuoles(▲)； d.necrolysis of renal tubules(→)，renal interstitial congestion and hemorrhage(▲)； e.lymphocyte infiltration(→)；f.extensive congestion of spleen(→)，lymphocyte infiltration(▲)； g.lymphocyte necrosis and decrease in number (→)，hemosiderin deposition(▲)； h.necrosis and exfoliation of intestinal epithelial cells(→)； i.eosinophils in intestinal submucosa(→),lymphocyte infiltration (▲)； j.gill lamellae epithelial cell exfoliation(→)，eosinophil infiltration(▲)； k.myocardial centriomyocytes(→),lymphocyte infiltration (▲)； l.eyeball choroid shows diffusive hemorrhage and hyperemia(→).

3 討 論

3.1 嗜水氣單胞菌感染魚(yú)類(lèi)的臨床表現(xiàn)

3.2 病理?yè)p傷與發(fā)病機(jī)制

嗜水氣單胞菌是典型的條件性致病菌，平時(shí)和水體中的魚(yú)類(lèi)共存而不發(fā)病，當(dāng)水溫達(dá)到25 ℃時(shí)，水環(huán)境中菌體大量繁殖，是感染魚(yú)類(lèi)的誘因，本病例的養(yǎng)殖池塘5月氣溫急劇升高，病原菌復(fù)蘇，同時(shí)池塘3年未清淤，氨氮、亞硝態(tài)氮均嚴(yán)重超標(biāo)(氨氮1.5 mg/L，亞硝態(tài)氮0.5 mg/L)，魚(yú)體免疫力下降，暴發(fā)疾病。本試驗(yàn)中肝靜脈、心室、脾臟、腸道黏膜下層出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這是魚(yú)類(lèi)細(xì)菌感染后出現(xiàn)的積極免疫應(yīng)答表現(xiàn)；同時(shí)該菌在宿主體內(nèi)大量繁殖，分泌毒素(主要有溶血素、細(xì)胞毒素、腸毒素)經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)各組織器官，這些毒素均具有很強(qiáng)的溶血性、細(xì)胞毒性和腸毒性[18]，造成紅細(xì)胞裂解、毛細(xì)血管損傷、通透性增大，紅細(xì)胞游走出血管外，因此本試驗(yàn)表現(xiàn)出腎間質(zhì)、脾臟、眼球出血的病理變化，同時(shí)毒素引起肝、腎、脾組織細(xì)胞損傷，由顆粒變性、空泡變性到后期局灶性壞死，腸黏膜脫落，這與周碧君等[9,11]的研究結(jié)果一致。

3.3 治療與預(yù)防

由于抗生素使用不合理、質(zhì)粒及耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移等因素，近年來(lái)魚(yú)源嗜水氣單胞菌多重耐藥現(xiàn)象普遍，表現(xiàn)出耐藥譜廣、耐藥率高的特點(diǎn)[19-20]，本試驗(yàn)結(jié)果表明，只有4種(兩類(lèi))藥物對(duì)嗜水氣單胞菌CW敏感，同樣表現(xiàn)出極高的耐藥譜。氧氟沙星、諾氟沙星、吡哌酸3種敏感藥物為喹諾酮類(lèi)，相關(guān)研究表明，嗜水氣單胞菌對(duì)該類(lèi)藥物具有極高的敏感性[21-22]。敏感藥物中的氧氟沙星、諾氟沙星、妥布霉素這3種藥物均為禁用獸藥，則吡哌酸成為唯一的選擇，反觀該地區(qū)臨床用藥，未針對(duì)疾病進(jìn)一步診斷就盲目使用抗生素大劑量?jī)?nèi)服，若無(wú)明顯效果則換另一種抗生素，延誤疾病治療，造成不必要損失，同時(shí)也增加了環(huán)境中嗜水氣單胞菌的獲得性耐藥，形成常用藥物完全無(wú)效現(xiàn)象，為當(dāng)前疾病的治療帶來(lái)了很大困難。臨床上應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果科學(xué)用藥，同時(shí)在養(yǎng)殖過(guò)程中注重養(yǎng)殖水環(huán)境的調(diào)節(jié)，使用有益微生物競(jìng)爭(zhēng)抑制病原菌，預(yù)防疾病的發(fā)生，保證水產(chǎn)品的健康安全。

4 結(jié) 論