梁 婧，胡秀彩，呂愛(ài)軍，孫敬鋒

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384 )

水生拉恩菌(Rahnellaaquatilis)，屬腸桿菌科，拉恩菌屬，為革蘭氏陰性直桿菌，有鞭毛，大小為(0.5～0.7) μm×(2～3) μm，兼性厭氧，化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)菌[1]。最早自淡水中分離獲得水生拉恩菌，DNA雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2菌株與腸桿菌屬細(xì)菌相似性僅有37%，從而將其確定為一個(gè)新屬種[2-3]。水生拉恩菌在自然界中分布廣泛，主要存在于淡水、土壤中[4-5]。在人體、蝸牛腸道以及動(dòng)、植物性食品中也可檢出水生拉恩菌[6]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，在牛奶[7]、雞蛋[8]、雞肉[9]以及魚粉、魚片[10]中分離檢測(cè)出該菌。最近，采用梅里埃API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)結(jié)合質(zhì)譜(MS)技術(shù)在野生綠頭鴨(Anasplatyrhynchos)[11]、斑頭雁(Anserindicus)[12]的糞便中檢測(cè)出水生拉恩菌。

水生拉恩菌作為一種條件致病菌，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物和人類均有致病性，可導(dǎo)致鯽魚(Carassiusauratus)[13]、雀鯛(Stegastesbeebei)[14]、中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)[15]患病，在感染過(guò)程中引起魚類體表胸鰭、尾鰭部位岀血和腹水等主要臨床癥狀。水生拉恩菌主要可以導(dǎo)致免疫低下人群感染，引起菌血癥、敗血癥等，但是目前對(duì)水生拉恩菌感染水生動(dòng)物確切的發(fā)病機(jī)理還知之甚少[16-18]。筆者較全面地綜述了水生拉恩菌的致病性、藥敏性、基因組特征以及理化與分子鑒定等國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，旨在為水生拉恩菌分子流行病學(xué)、致病機(jī)理、功能基因組學(xué)以及診斷與防治研究提供科學(xué)參考。

1 水生拉恩菌的致病性與藥敏性

1.1 對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的致病性

近幾年，對(duì)水生拉恩菌感染魚類的組織分布、致病機(jī)理及其分子診斷等相關(guān)研究備受關(guān)注[13-15]。研究表明，水生拉恩菌在污染魚類肌肉、腸道及內(nèi)臟組織器官中比較常見(jiàn)[13,16]。Alikunhi等[17]基于16S rRNA測(cè)序證實(shí)水生拉恩菌為魚類肌肉污染樣品中的優(yōu)勢(shì)菌種。周玉法等[18]發(fā)現(xiàn)，草魚(Ctenopharyngodonidellus)和鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)的腸道微生物主要菌群為拉恩氏菌屬細(xì)菌，其含量達(dá)106cfu/g數(shù)量級(jí)。Lü等[13]自患病鯽魚體內(nèi)(肝胰臟、腎臟和脾臟)中分離獲得革蘭氏陰性桿菌KCL-5，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)觀察、生理生化特征以及16S rDNA和gyrB基因測(cè)序鑒定KCL-5菌株為水生拉恩菌。Xue等[15]從中國(guó)林蛙肝臟中分離出1種革蘭氏陰性菌bf008，發(fā)現(xiàn)該菌與12個(gè)水生拉恩菌參考菌株的親緣關(guān)系最近，最終將bf008分離菌株鑒定為水生拉恩菌。Wei等[19]從蝦虎魚(Yongeichthyscriniger)肝臟分離到產(chǎn)河豚毒素XL-1菌株，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，菌株XL-1與水生拉恩菌親緣關(guān)系最近。Skrodenyte等[20]通過(guò)PCR擴(kuò)增和16S rRNA基因測(cè)序在亞?wèn)|鮭(Salmotruttafario)腸道中首次檢測(cè)水生拉恩菌(21%)。

Lü等[13]進(jìn)行水生拉恩菌KCL-5菌株的動(dòng)物感染試驗(yàn)，通過(guò)人工腹腔注射劑量為2.0×109cfu/mL對(duì)鯽魚的致病性研究，在攻毒試驗(yàn)14 d后感染鯽魚累積死亡率為73.3%，半數(shù)致死量為1.7×108cfu/mL，感染病鯽魚行動(dòng)緩慢，胸鰭基部、尾鰭等部位有岀血現(xiàn)象，腹腔有腹水，肝臟和腎臟等臟器處有瘀血點(diǎn)。最近，Lamb等[14]從患病雀鯛和鋸鱗魚(Myripristisleiognathus)皮膚病變部位中分離出2株細(xì)菌，通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序?qū)⑵滂b定為拉恩菌屬一個(gè)新種(R.inusitata)，患病魚主要表現(xiàn)為皮膚損傷，鱗屑和表皮之間出血，背鰭基部病變明顯，皮膚與肌肉層容易分離等臨床癥狀。水生拉恩菌毒力因子主要有從魚肉中檢測(cè)出的水生拉恩菌熱不穩(wěn)定毒素(lt)基因、熱穩(wěn)定毒素(st)基因等[7]，以及在KCL-5菌株中檢測(cè)到y(tǒng)haV毒力基因[13]。除此之外，水生拉恩菌的發(fā)病機(jī)制可能與脂多糖(LPS)有關(guān)，認(rèn)為脂多糖?；土姿峄鶊F(tuán)是影響其毒性強(qiáng)弱的主要因素[21-23]。

1.2 對(duì)人的致病性

水生拉恩菌對(duì)人有致病性，可感染血液導(dǎo)致人類的菌血癥[24]、敗血癥[25]、心膜炎[26]、中耳炎[27]以及腸胃炎等[28]多種疾病，感染后主要引起腹痛、腹瀉、發(fā)熱、咳嗽等一系列癥狀，并可以在患者之間交叉?zhèn)鞑ジ腥綶28-33]。多數(shù)水生拉恩菌感染人導(dǎo)致條件性致病，尤其對(duì)免疫功能低下者，或存在外科傷口、老人和兒童等更易感染[31,34]。近年來(lái)，主要從糖尿病、免疫缺陷、腫瘤患者等有基礎(chǔ)疾病人群的臨床病例樣品中分離，包括創(chuàng)傷、菌血癥、艾滋病、白血病、胃腸炎以及免疫功能低下患者[31-33]，偶爾也從健康人痰液、尿液、血液和糞便分離獲得[29-30]。但是，對(duì)人類感染水生拉恩菌的分子致病機(jī)理研究，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

1.3 藥敏性

研究表明，大多數(shù)水生拉恩菌對(duì)氨基糖苷類(慶大霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素等)、四環(huán)素和喹諾酮類等藥物敏感，有些菌株對(duì)碳青霉烯類、呋喃類天然敏感；多數(shù)對(duì)頭孢菌素類、青霉素類耐藥[5]；也有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)磺胺類藥物(磺胺甲惡唑、復(fù)方新諾明等)敏感或耐藥[25,32]。一般認(rèn)為，水生拉恩菌分離株耐藥性存在差異，這可能與不同菌株來(lái)源、環(huán)境、患者個(gè)人身體狀況以及使用藥物治療有關(guān)。已報(bào)道水生拉恩菌和水生拉恩菌基因組2菌株無(wú)天然抗生素敏感性差異，而吡咯烷酮肽酶(Pyrase)敏感性可能成為區(qū)分水生拉恩菌和水生拉恩菌基因組2菌株的決定因素[35]。

最近，從鯽魚體內(nèi)分離出的水生拉恩菌KCL-5分離株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、氨基糖苷類、氯霉素等藥物高度敏感，但對(duì)頭孢菌素和磺胺類藥物有耐藥性[13]。Xue等[15]報(bào)道蛙源分離株bf008對(duì)磷霉素和頭孢唑林等藥物耐藥，對(duì)頭孢哌酮、頭孢西丁等藥物敏感，這與從人類臨床檢測(cè)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本相符[13,15]。研究表明，A類超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是一類由質(zhì)粒介導(dǎo)，能水解廣譜青霉素、頭孢霉素、單環(huán)酰胺類、β-內(nèi)酰胺類藥物的高活性β-內(nèi)酰胺酶，可通過(guò)水解滅活頭孢菌素類抗生素，對(duì)內(nèi)酰胺酶抑制劑(克拉維酸)等敏感[36-37]，這與水生拉恩菌耐藥性基本一致。對(duì)水環(huán)境腸桿菌而言，A類超廣譜β-內(nèi)酰胺酶被認(rèn)為是引起人類感染的耐藥基因來(lái)源，水生拉恩菌也可以產(chǎn)生A類超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(RAHN-1、RAHN-2)[38]，以上研究有助于理解水生拉恩菌的耐藥機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。

2 基因組特征

近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)飲用水、植物根際土壤等來(lái)源的水生拉恩菌基因組研究進(jìn)行了文獻(xiàn)報(bào)道[39-42]。Martinez等[40]在法國(guó)飲用水中分離獲得水生拉恩菌CIP 78.65菌株(同等于模式菌株ATCC 33071)，最早于2012年報(bào)道其全基因組序列。結(jié)果表明，該菌株CIP 78.65基因組由1個(gè)環(huán)狀染色體、3個(gè)質(zhì)粒組成，其中染色體大小為4 861 101 bp、GC比例為52.12%，質(zhì)粒pRahaq201、pRahaq202、pRahaq203長(zhǎng)度分別為463 906 bp(GC比例52.29%)、115 487 bp(GC比例50.69%)和8604 bp(其中含有一個(gè)缺口補(bǔ)全長(zhǎng)度為1950 bp)。通過(guò)生物信息學(xué)方法分析，發(fā)現(xiàn)CIP 78.65菌株共有4970個(gè)推測(cè)基因編碼蛋白、104個(gè)假基因、76個(gè)tRNA基因和7個(gè)rRNA基因操縱子。

Guo等[41]從北京葡萄園土壤中分離出1株水生拉恩菌HX2菌株，并研究報(bào)道其基因組序列草圖，該基因組包括1個(gè)環(huán)狀染色體大小為4 962 173 bp，2個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒pRA1、pRA2長(zhǎng)度分別為570 951 bp、123 675 bp，推測(cè)含有4541、519和120個(gè)基因蛋白開(kāi)放閱讀框(ORFs)。該基因組包括76個(gè)tRNA基因、22個(gè)rRNA基因操縱子。此外，HX2菌株染色體GC比例為52.2%，質(zhì)粒pRA1、pRA2的GC比例分別為52.0%、50.9%。

Martinez等[42]從美國(guó)低pH、高含量硝酸鹽、重金屬等污染土壤中分離拉恩菌屬未定新種(Rahnellasp.)Y9602菌株，對(duì)其全基因組序列研究報(bào)道。結(jié)果表明，Y9602菌株基因組大小為5 614 252 bp，其中染色體大小為4 864 217 bp，GC比例為52.4%，含有2個(gè)質(zhì)粒pRAHAQ01、pRAHAQ02大小分別為616 549 bp(GC比例52.1%)、133 486 bp(GC比例48.3%)。該菌株基因組包含5184個(gè)蛋白編碼基因，73個(gè)假基因，76個(gè)tRNA基因和7個(gè)rRNA基因操縱子。

此外，Rbzhon等[43]對(duì)水生拉恩菌屬中53個(gè)分離菌株進(jìn)行基因組測(cè)序分析，在水生拉恩菌屬中共發(fā)現(xiàn)11個(gè)質(zhì)粒，其中7個(gè)屬于ColE1家族、1個(gè)屬于ColE2家族，還有3個(gè)與滾環(huán)質(zhì)粒同源性較高。截至2019年3月，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄有12株水生拉恩菌基因組序列，發(fā)現(xiàn)多數(shù)來(lái)源于土壤、水體，部分來(lái)源于人類和動(dòng)物性食品，多數(shù)菌株的基因組大小在3 995 000～5 656 799 bp，GC比例為52.08%～52.36%，編碼基因數(shù)量為3688～5243，編碼蛋白數(shù)量為3525～5012，假基因數(shù)量為7～125。由此，總結(jié)7個(gè)典型水生拉恩菌分離菌株的來(lái)源、基因組大小、GC比例、rRNA、tRNA基因、蛋白編碼基因、假基因數(shù)量等分子特征(表1)。

表1 水生拉恩菌的基因組特征Tab.1 Genomic characteristics of R. aquatilis

3 理化與分子鑒定

3.1 生理生化特性

水生拉恩菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和血瓊脂平板(BA)上容易生長(zhǎng)，其中大豆酪蛋白瓊脂平板上生長(zhǎng)較好。水生拉恩菌培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)灰白色、隆起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的圓形菌落，不溶血、不產(chǎn)色素。在25 ℃半固體生長(zhǎng)時(shí)，可由周鞭毛運(yùn)動(dòng)形成毛刷狀[1]。大多數(shù)水生拉恩菌分離菌株在4 ℃下生長(zhǎng)緩慢，可在25～35 ℃下生長(zhǎng)，最適pH 7.0～7.5[1,44]，可以利用有機(jī)酸、氨基酸作為碳源生長(zhǎng)[45,46]。在室溫、4 ℃條件下可以通過(guò)大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂保存，也可保存在10%甘油肉湯或-80 ℃牛血清中，其中冷凍干燥保藏法最佳[1]。

水生拉恩菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33071能發(fā)酵糖類產(chǎn)酸，包括阿拉伯糖、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、水楊苷等，并且硝酸鹽還原、氧化酶試驗(yàn)為陰性，過(guò)氧化氫酶為陽(yáng)性[1]。大多數(shù)菌株對(duì)苯丙氨酸脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、硫化氫、明膠液化試驗(yàn)等為陰性；可利用檸檬酸鹽，七葉苷水解為陽(yáng)性，吲哚、甲基紅和V-P試驗(yàn)呈弱陽(yáng)性。少數(shù)菌株對(duì)α-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、磷酸酶為陽(yáng)性，對(duì)賴氨酸分解酶、脂肪酶、精氨酸水解酶為陰性[1,47]。

最近，從患病鯽魚、雀鯛、鋸鱗魚和林蛙等水生動(dòng)物體內(nèi)分離到致病性水生拉恩菌。Lü等[13]對(duì)鯽魚水生拉恩菌KCL-5菌株、中國(guó)林蛙bf008菌株在氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶以及糖類利用等主要生理生化特性與模式菌株ATCC 33071進(jìn)行比較鑒定，結(jié)果表明，在利用葡萄糖、阿拉伯糖、山梨糖醇、阿糖醇等糖類發(fā)酵產(chǎn)酸特性一致，但是在氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、尿素酶等反應(yīng)特性明顯不同(表2)。

表2 水生拉恩菌的主要生理生化特性Tab.2 Biochemical and physiological characteristics of R. aquatilis

3.2 分子鑒定

近年來(lái)，主要采用16S rDNA、gyrB基因測(cè)序、DNA-DNA分子雜交技術(shù)等進(jìn)行水生拉恩菌的分子鑒定[48-52]。Brenner等[45]采用常規(guī)細(xì)菌生化試驗(yàn)、碳源利用試驗(yàn)、DNA雜交(羥基磷灰石法)和16S rRNA測(cè)序等方法，對(duì)水體、蝸牛和人源水生拉恩菌進(jìn)行分類與鑒定，結(jié)果表明，51株分離菌株由拉恩菌屬中3個(gè)親緣關(guān)系密切的基因種組成，但是通過(guò)生物表型無(wú)法區(qū)分水生拉恩菌和另2個(gè)新分離菌種的確切關(guān)系，因此通過(guò)16S rRNA測(cè)序分析將新物種命名為水生拉恩菌基因種2和基因種3。目前，水生拉恩菌屬含有水生拉恩菌一個(gè)模式種，已發(fā)現(xiàn)5個(gè)新種，分別為R.victorianasp. nov.(模式菌株FRB 225=LMG 27717=DSM 27397)、R.variigenasp. nov.(水生拉恩菌基因種2、模式菌株CIP 105588=LMG 27711)，R.inusitatasp. nov.(水生拉恩菌基因種3、模式菌株DSM 30078=LMG 2640)，R.bruchisp. nov.(模式菌株FRB 226=LMG 27718=DSM 27398)和R.woolbedingensissp. nov.(模式菌株FRB 227= LMG 27719= DSM 27399)[48]。Bakhshandeh等[44]通過(guò)檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rDNA序列對(duì)從土壤中分離菌株M100進(jìn)行分子鑒定，證實(shí)M100菌株為水生拉恩菌，16S rDNA序列相似性為99%。最近，Xue等[49]從黨參(Codonopsisclematidea)根際土壤中分離到一株革蘭氏陰性菌SYP-B210T，采用16S rRNA基因測(cè)序?qū)⑵滂b定為水生拉恩菌。Li等[50]從中國(guó)東部某地土壤中篩選出17株菌株，通過(guò)16S rDNA基因測(cè)序、Biolog鑒定系統(tǒng)及生物學(xué)表征，將其中分離菌株JZ-GX1鑒定為水生拉恩菌。Brady等[48]從患病植物根際土壤中分離到32株革蘭氏陰性菌株，采用gyrB、rpoB、infB和atpD等基因序列多位點(diǎn)分析(MLSA)、16S rRNA基因測(cè)序、微孔板和微量培養(yǎng)板進(jìn)行DNA-DNA雜交檢測(cè)、熒光測(cè)定方法鑒定發(fā)現(xiàn)水生拉恩菌為優(yōu)勢(shì)菌株。Yu等[51]通過(guò)16S rRNA序列長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)方法檢測(cè)表明，水生拉恩菌在蝠蛾(Hepialusgonggaensis)腸道菌群中為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，在16S rRNA克隆文庫(kù)中約為45.6%。Zhao等[52]從銅污染土壤中分離菌株LRP3，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)和16S rRNA序列分析，鑒定LRP3菌株為水生拉恩菌。

3.3 其他特性

近幾年，有文獻(xiàn)報(bào)道一些水生拉恩菌分離菌株具有益生特性，在植物病害防治、環(huán)境污染處理等方面有應(yīng)用前景[42,53]。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，水生拉恩菌在奶牛糞便好氧降解過(guò)程中為優(yōu)勢(shì)菌種，并在體外顯示較強(qiáng)的植酸鹽利用性[54]，此外，水生拉恩菌還可以固定氮，產(chǎn)生吡咯喹啉奎寧[41]、吲哚-3-乙酸和抗菌物質(zhì)，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)并且抑制根莖疾病[44,53]。水生拉恩菌不僅具有溶解礦物磷酸鹽的能力，在被污染的水源中可促進(jìn)磷酸鈾礦化，而且可以產(chǎn)生植酸酶和堿性磷酸酶等多種活性物質(zhì)，對(duì)重金屬污染土壤的生物修復(fù)起重要作用[52]。

4 研究展望

水生拉恩菌作為一種條件性致病菌，國(guó)內(nèi)外的研究仍處于初步開(kāi)展階段，主要集中在人類臨床檢測(cè)、繼發(fā)感染病例的研究報(bào)道[27]，針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物致病性菌株的分離鑒定與致病性研究相對(duì)較少。迄今，僅有對(duì)植物、土壤源水生拉恩菌基因組測(cè)序研究報(bào)道[40-41]。然而，目前尚未見(jiàn)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物致病性水生拉恩菌基因組測(cè)序的分析研究。最近，筆者及其課題組已從發(fā)病鯽魚體內(nèi)分離到致病性水生拉恩菌KCL-5菌株，同時(shí)進(jìn)行基因組測(cè)序研究工作，并發(fā)現(xiàn)該菌基因組的分子特征及一些耐藥和毒力基因(待整理發(fā)表)。此外，人們僅發(fā)現(xiàn)鯽魚源水生拉恩菌毒力yhaV基因[13]以及食物源毒力因子熱不穩(wěn)定毒素(lt)基因、熱穩(wěn)定毒素(st)基因[7]與其致病性有關(guān)，也有報(bào)道該菌含有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶RAHN-1、RAHN-2耐藥基因等[38]。研究表明，水生拉恩菌毒力yhaV基因是一種核糖體依賴性毒素，屬于大腸桿菌(Escherichiacoli)Ⅱ型毒素—抗毒素(TA)系統(tǒng)[55]，主要通過(guò)與70S或50S核糖體亞基結(jié)合，從而切割依賴性mRNA翻譯[56]，但其靶mRNA調(diào)控機(jī)制仍無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。由此可見(jiàn)，水生拉恩菌毒力和耐藥基因功能以及確切的致病機(jī)制等仍不清楚，今后對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物水生拉恩菌的流行病學(xué)、致病機(jī)理以及功能基因組學(xué)的分析，有待于進(jìn)一步深入開(kāi)展研究。